李瑩瑩，吳彩娥,*，楊劍婷，范龔健

(1.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037；2.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

白果過敏蛋白及其過敏原性研究

李瑩瑩1，吳彩娥1,*，楊劍婷2，范龔健1

(1.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037；2.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

對白果的主要過敏蛋白進行鑒定，并對其過敏原性進行分析。以SDS-PAGE和Western-Blotting分析鑒定白果蛋白提取液中的蛋白質(zhì)組分和過敏蛋白，通過間接ELISA法檢測過敏小鼠血清中sIgE的效價。白果的蛋白質(zhì)條帶主要有13條，其中以21kD和32kD含量最多。Western-Blotting分析結(jié)果表明，白果蛋白中存在3條過敏原蛋白，分子質(zhì)量分別為21、32、36kD。當酶標二抗稀釋度為1:1000，白果蛋白包被質(zhì)量濃度為50μg/mL，間接ELISA測得過敏小鼠血清中sIgE的效價為1:6400。對白果蛋白進行分析鑒定，明確了白果中存在的過敏原蛋白。

白果；過敏蛋白；SDS-PAGE；Western-Blotting；間接ELISA

食物過敏是指當人體攝入某種特定的食物后在體內(nèi)發(fā)生的由E型抗體(IgE)介導的液體免疫反應。在過敏反應中，有90%以上是由蛋類、花生、乳類、大豆、小麥、樹生堅果(杏、板栗、腰果等)、貝類(包括甲殼類和軟體動物)、魚等[1]8類食物引起的。一般食物中使機體產(chǎn)生過敏并與IgE等抗體結(jié)合的都為蛋白質(zhì)[2]。

銀杏為裸子植物門銀杏綱銀杏植物(Gingko bilba L.)，為一科一屬一種的特殊植物，是我國特有的古老珍貴樹種之一[3]。銀杏種實去掉肉質(zhì)外種皮后的部分俗稱白果。白果富含淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)以及銀杏酸、白果酚、五碳多糖、膽固醇等功能成分[4]，自古以來被當作養(yǎng)生延年的上品。但是，生食白果或進食太多，會引起過敏反應，臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、煩躁不安、昏迷、抽搐、呼吸困難、瞳孔放大伴隨著對光反應遲鈍，乃至死亡[5]。Baron-Ruppert等[6]研究認為導致白果過敏主要物質(zhì)是烷基酚類化合物，Arenz等[7]研究認為4-O-甲基吡哆醇(4-OMethylpyridoxine，MPN)可能有致敏作用。楊劍婷等[8]通過對白果過敏的相關(guān)數(shù)據(jù)分析，認為白果中可能存在其他類型的致敏物質(zhì)。

白果中含有8.7%～13.4%的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成豐富、合理，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。近年來，關(guān)于白果蛋白的研究主要集中于白果蛋白組成及其功能上。Uwe等[9]在1989年從白果中分離出一種類似豆球蛋白的物質(zhì)。牛衛(wèi)寧等[10]報道了從白果中提取得到的蛋白具有抗菌作用。黃文等[11]應用不同的提取方法，分離出白果清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白等，發(fā)現(xiàn)白果中的蛋白質(zhì)主要以清蛋白和球蛋白為主，其中白果清蛋白具有抗氧化和延緩衰老等作用。有研究表明，食物中90%的過敏原是蛋白質(zhì)，郭紅彥等[12]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏枝條中的32、36kD貯藏蛋白具有免疫原性。本課題組在此基礎(chǔ)上，已應用豚鼠為實驗動物，明確了白果蛋白具有致敏性，并建立了白果蛋白過敏反應的小鼠模型[13]，本研究正是基于此模型，初步鑒定白果中的過敏蛋白，并對其過敏原性進行分析，旨在明確白果中的過敏蛋白及其過敏原性，以期為過敏性疾病的特異性診斷以及白果食品的安全開發(fā)提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

白果為大佛指品種，購自江蘇泰興。

1.1.2 試劑與儀器

HRP(辣根過氧化物酶)標記的羊抗鼠IgE抗體、SDSPAGE凝膠電泳所用試劑 美國Sigma公司；低分子質(zhì)量蛋白標準、葡萄糖、牛血清蛋白 上海生化試劑公司；鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑 華美公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

TU-1800PC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；GL-20G- II型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-25型pH計 上海智光儀器儀表有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24D垂直板電泳槽 北京六一儀器廠；BIO-RAD電泳自動成像儀、BIO-RAD半干式轉(zhuǎn)印儀 美國BIO-RAD生化科技有限公司；Thermo354型酶標儀、96孔酶標板 Thereto Labsystem公司。

1.1.3 動物

小鼠，健康成年昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由南京江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 白果蛋白粗提液的制備

取白果50g，冷凍干燥后，研磨過篩，5倍體積石油醚脫脂至脫脂完全為止，待石油醚完全揮發(fā)后，以1:20 (m/V)的比例加入pH 8.5、0.15mol/L Tris-HCl溶液進行蛋白提取，4℃下磁力攪拌24h，12000r/min冷凍離心20min，上清液通過40～80g/100mL飽和度的(NH4)2SO4沉淀，12000r/min離心10min，沉淀用pH 7.4、0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，采用透析袋用PBS進行透析。透析完全后，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫小鼠模型的建立

成年小鼠分成3組，每組40只雄性。實驗組分為陰性對照組、白果蛋白組、陽性對照組，具體如下：陰性對照組：0.2mol/L、pH 7.4的Tris-HCl經(jīng)口灌胃致敏和腹腔注射激發(fā)；白果蛋白組：100mg/mL白果蛋白經(jīng)口灌胃致敏、200mg/mL白果蛋白經(jīng)口灌胃激發(fā)；陽性對照組：0.50mg/mL的卵白蛋白經(jīng)口灌胃致敏、1.0mg/mL卵白蛋白腹腔注射激發(fā)。

每組小鼠均在第1、7、14 天致敏，第21 天激發(fā)。致敏、激發(fā)劑量均為0.3mL/10g體質(zhì)量。末次激發(fā)后第14天采血，收集的血清放置在室溫中自然凝固3～4h。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000r/min離心15min，取上清，分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

測定時，取5mL血清與等量的生理鹽水混合后，緩慢加入20g/100mL的硫酸銨使有沉淀產(chǎn)生。充分混合后，4℃放置30min；后于3000r/min離心20min，棄沉淀，上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至濃度為50g/100mL，4℃放置30min，經(jīng)5000r/min離心30min，收集沉淀溶于10mL的生理鹽水，加入硫酸銨至終濃度為33g/100mL， 4℃放置30min，后于3000r/min離心20min，沉淀以33g/100mL飽和度的硫酸銨溶液洗滌兩次后，溶解于l0mL生理鹽水中，置于透析袋中在生理鹽水中透析過夜，處理好的血清用于IgE測定。

1.2.3 SDS-PAGE分析

調(diào)整白果蛋白粗提物質(zhì)量濃度為1mg/mL，將白果蛋白提取液與樣品緩沖液按1:1的比例混合，100℃煮沸5min，12000r/min離心5min，上樣20μL，12%分離膠，3.9%濃縮膠。開始電流10mA，進入分離膠后為20mA，電泳時間為2.5～3.5h。考馬斯亮藍R-250染色，過夜，放入脫色液中脫色，直至膠片背景藍色完全透明狀。BIO-RAD電泳自動成像儀拍照，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量運用Quality one軟件進行分析。

1.2.4 Western-Blotting分析

使用BIO-RAD 半干式轉(zhuǎn)印儀將SDS-PAGE凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF(聚偏氟乙烯) 膜上；轉(zhuǎn)移結(jié)束后，0.01mol/L PBS洗膜，5min ×3次，將膜用5g/100mL OVA (卵蛋白)封閉2h；PBST漂洗，加入抗血清(按1:100 稀釋)，設(shè)陰性對照，4℃放置12h以上；PBST 漂洗，5min× 3次，加入羊抗鼠IgE-HRP(按1:500 稀釋)，室溫孵育2h，PBST 漂洗，5min×3次。加入DAB顯色液，顯色后用水終止反應，結(jié)果拍照保存。

1.2.5 間接ELISA檢測抗血清中sIgE

用包被緩沖液將白果蛋白稀釋至一定質(zhì)量濃度，加到96孔酶標板，100μL/孔，4℃過夜；次日用PBST液洗滌3次，拍干；將酶標板孔內(nèi)加入封閉液，200μL/孔，37℃恒溫箱中孵育2h，同上洗滌；將一定質(zhì)量濃度的抗血清加入板孔，100μL/孔，37℃恒溫箱中孵育2h，同上洗滌；加入羊抗鼠IgE-HRP，100μL/孔，37℃恒溫箱中孵育2h，同上洗滌；再加現(xiàn)配制的OPD底物顯色液，37℃避光顯色30 min；加入2mol/L的H2SO4終止液，每孔50μL，用 ELISA 酶標儀于492nm波長處，以空白對照孔調(diào)零后測定各孔OD值。結(jié)果判定：計算待檢測孔與陰性對照孔的 OD492nm之比(P/N)，當 P/N≥2.1時，為陽性；當P/N＜2.1時，為陰性。

1.2.5.1 酶標二抗?jié)舛鹊拇_定

按照ELISA操作步驟，用包被緩沖液將抗血清稀釋為1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400；將羊抗鼠IgE-HRP，分別稀釋為1:500、1:1000、1:2000，依次加入酶標板，兩者37℃作用2h后，再加底物液作用30min，加終止液，在酶標儀上讀取OD492nm值。

1.2.5.2 抗原最佳包被質(zhì)量濃度和抗血清最佳稀釋度的確定

采用棋盤法。將包被抗原稀釋為5、10、50μg/mL和100μg/mL，加入到酶標板中，每行1個稀釋度，4℃過夜；將抗血清稀釋為1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800加入酶標板中，每一列為1個稀釋度，37℃孵育2h。其余反應同ELISA操作步驟，測定各孔OD492nm。

1.2.6 抗血清sIgE效價的測定

將抗血清按照 1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800的比例稀釋，采用間接 ELISA法測定其效價。以陽性血清和陰性血清的OD492nm之比(P/N)大于2.1的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體的效價。

1.2.7 蛋白質(zhì)量濃度的測定

應用Bradford法[14]，以牛血清蛋白為標準蛋白，標準曲線方程為Y=8.2134X+0.0214(R2=0.9985)。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用DPS(version 3.01)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，設(shè)置顯著水平分別為P＜0.05及P＜0.01。所有實驗設(shè)3次重復，結(jié)果均為平均值，以平均值±標準誤表示，并進行方差分析和Duncan s檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 白果蛋白粗提液SDS-PAGE電泳分析

對白果蛋白提取液進行SDS-PAGE凝膠電泳，如圖1所示。白果的蛋白質(zhì)條帶主要有13條，其分子質(zhì)量介于10～100kD之間，白果蛋白分子質(zhì)量最大為99kD，最小的為13kD，其中含量高的有6條，分子質(zhì)量分別為15、21、32、36、48、69kD，其中以21kD和32kD含量最多。白果的蛋白條帶主要集中在31～100kD，占蛋白總條數(shù)的77%，其余蛋白條帶集中在13～22kD范圍內(nèi)，可見白果蛋白多以大分子的結(jié)構(gòu)存在，蛋白質(zhì)帶表現(xiàn)出了良好的多態(tài)性。白果中蛋白種類豐富，主要存在分子質(zhì)量為21kD和32kD的兩種蛋白，以及十余種含量略低的其他蛋白，大分子蛋白較多。

圖1 白果蛋白提取液的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of ginkgo seed proteins

2.2 Western-Blotting分析鑒定白果的主要過敏蛋白

Western-Blotting是將經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(PVDF膜)上，以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色以檢測電泳分離的特異性的蛋白成分。將白果蛋白進行Western-Blotting分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 白果蛋白的Western-Blotting結(jié)果Fig.2 Western-Blotting of ginkgo seed proteins

過敏小鼠血清經(jīng)免疫印跡檢測均有陽性區(qū)帶產(chǎn)生，而陰性對照血清未顯示特異性IgE結(jié)合區(qū)帶。白果蛋白組分中可與過敏小鼠抗血清中的IgE特異性結(jié)合的主要有3種蛋白組分，其分子質(zhì)量分別為21、32、36kD，可初步確定其為白果中主要的過敏原蛋白。據(jù)報道，大豆中的3種主要致敏原是Glym Bd 30k、Glym Bd 28k和β-伴大豆球蛋白，其分子質(zhì)量分別為30、28kD，而大米中已分離得到的6種過敏蛋白，分子質(zhì)量分別為14、15、16、26、33kD和56kD[15]，可見，白果過敏蛋白與其他核果類過敏原中存在的主要過敏原蛋白在分子質(zhì)量上具有一定的相似性。

2.3 間接ELISA檢測抗血清中sIgE

2.3.1 酶標二抗?jié)舛鹊拇_定

分別將羊抗鼠IgE-HRP稀釋為1:500、1:1000和1:2000，在不同的抗血清稀釋度下測得的OD492nm如圖3所示。

圖3 不同血清稀釋度下HRP-羊抗鼠IgE稀釋度的OD492nmFig.3 Plot of OD492nmversus different dilutions of antiserum with different dilutions of goat anti-mouse IgE-HRP

隨著羊抗鼠IgE-HRP稀釋度增大，各孔OD值逐漸減小。當羊抗鼠IgE-HRP稀釋至1:2000時，OD值較稀釋度1:500和1:1000顯著降低(P＞0.05)。但羊抗鼠IgEHRP稀釋為1:500和1:1000，OD492nm值較接近。一般情況下，ELISA檢測儀在檢測OD值時，OD值為1.0左右時誤差最小，反應最靈敏[16]。羊抗鼠IgE-HRP在稀釋度1:1000，血清稀釋度為1:400時，OD492nm為0.992，接近1.0，另外從節(jié)約成本角度考慮，本實驗確定酶標二抗的最佳工作稀釋度為1:1000。

2.3.2 抗原最佳包被質(zhì)量濃度和抗血清最佳稀釋度的確定

通過以不同質(zhì)量濃度的白果蛋白包被酶標板，然后加入不同稀釋度的抗血清，再通過酶標二抗的作用，不同質(zhì)量濃度的過敏原與不同稀釋度的抗血清作用的OD492nm值，結(jié)果見圖4。隨著抗血清稀釋度的增加，不同抗原包被質(zhì)量濃度下測得的OD值逐漸減小，當包被的白果蛋白質(zhì)量濃度為50μg/mL和100μg/mL時測得的OD值較高，當包被的白果蛋白質(zhì)量濃度為50μg/mL，血清稀釋度為1:500時，OD492nm為0.997，接近1.0，且此時陽性血清和陰性血清的OD492nm的比值P/N為8.982，其值遠遠大于2.1，因此確定抗原的最佳包被質(zhì)量濃度為50μg/mL，包被是ELISA實驗中關(guān)鍵的一步，如果質(zhì)量濃度過低，包被液中的蛋白質(zhì)不能完全覆蓋固相載體表面，隨后加入的特異性抗體和酶標二抗就有可能直接被吸附到固相載體上，最后產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測結(jié)果偏高[17]；質(zhì)量濃度過高，蛋白質(zhì)分子的相互作用影響聚苯乙烯與蛋白質(zhì)之間的吸附，以至在隨后的抗原抗體反應、洗滌等步驟中，部分抗原或與抗體結(jié)合釋放到洗滌液中被棄去，或直接釋放到洗滌液中造成抗原的浪費[18]，本實驗確定抗原的最佳包被質(zhì)量濃度為50μg/mL，取得了較好的包被效果。

圖4 白果蛋白不同包被質(zhì)量濃度時不同稀釋度血清的OD492nmFig.4 Plot pf OD492nm versus different dilutions of antiserum with different coating concentrations of ginkgo seed proteins

2.4 抗血清sIgE效價的測定

本實驗采用間接ELISA法測定經(jīng)白果蛋白免疫后的過敏小鼠血清中sIgE的效價，以陽性血清和陰性血清的OD492nm之比(P/N)大于2.1的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體的效價，結(jié)果見表1。

表1 抗血清IgE效價測定結(jié)果Table 1 Determination results of mouse serum IgE titer

將抗血清按照一定的比例稀釋后，除抗血清稀釋度為1:12800外，其余稀釋度中各反應皆為陽性反應，陽性血清和陰性血清的OD492nm之比P/N都大于2.1，因此確定抗血清中sIgE的效價為1:6400。本實驗測得的sIgE的效價較報道的其他過敏原效價較低[17]，分析原因，可能是因為酶聯(lián)免疫是很強的非特異性吸附反應，而制得的多克隆抗體只經(jīng)過硫酸銨沉淀未經(jīng)過層析法進一步純化，使得制得的多克隆抗體中除了一些特異性的抗體以外，還有存在某些雜質(zhì)和其他抗體成分，這些物質(zhì)的存在一定程度上降低了特異性抗體的靈敏性[19]。

目前，測定抗體效價的方法很多，結(jié)果比較粗放，采用瓊脂擴散的方法比較多，但由于影響因素比較多，而且敏感度比較低[20]。間接酶聯(lián)免疫的方法克服了這些缺點，而且操作簡便。由于多克隆抗體存在大量的抗原決定簇，很容易和抗體進行結(jié)合，特別適合于用酶聯(lián)免疫的方法檢測，而且在檢測過程中經(jīng)常采用酶聯(lián)免疫的方法，能夠?qū)σ院髾z測過程中抗體的使用提供直接的指導。

3 結(jié) 論

3.1 通過Tris-HCl法提取白果蛋白，并采用SDS-PAGE分析白果蛋白的分子組成及其分子質(zhì)量，結(jié)果表明，白果的蛋白質(zhì)條帶主要有13條，其中以21kD和32kD含量最多。

3.2 通過Western-Blotting分析鑒定白果的主要過敏原，結(jié)果初步表明白果中主要存在3種蛋白過敏原，其分子質(zhì)量分別為21、32、36kD。

3.3 采用間接ELISA法測定經(jīng)白果蛋白免疫后的過敏小鼠血清中sIgE的效價，結(jié)果表明當酶標二抗?jié)舛葹?:1000，白果蛋白包被質(zhì)量濃度為50μg/mL時，測得過敏小鼠血清中sIgE的效價為1:6400。

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Identification and Allergenicity of Allergic Proteins in Ginkgo Seeds

LI Ying-ying1，WU Cai-e1,*， YANG Jian-ting2，F(xiàn)AN Gong-jian1
(1.College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China；2.College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

SDS-PAGE and Western-Blotting were used to identify the protein composition and allergic proteins of ginkgo seed extract, respectively. A total of 13 bands were observed in the SDS-PAGE pattern, and the fractions of 21 kD and 32 kD exhibited the highest content. Western-Blotting analysis indicated that ginkgo seeds had 3 allergic proteins, whose molecular weights were 21, 32 kD and 36 kD, respectively. When the enzyme secondary antibody concentration was 1:1000 and the ginkgo protein coating concentration was 50μg/mL, the serum IgE titer of mice allergic to ginkgo seeds was detected to be 1:6400 by indirect ELISA.

ginkgo seed；allergic protein；SDS-PAGE；Western-Blotting；indirect ELISA

Q816

A

1002-6630(2011)07-0016-05

2010-06-30

教育部博士點基金項目(200802980004)

李瑩瑩(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為經(jīng)濟植物資源加工利用及其安全控制。E-mail：njliyingying@yahoo.com.cn

*通信作者：吳彩娥(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品活性成分提取及食品安全控制。E-mail：sxwucaie@163.com