張小飄綜述,聶 明審校

(湖北省襄樊市第一人民醫(yī)院檢驗科 441000）

酶聯(lián)免疫斑點(enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT)檢測技術(shù)結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)的長處,能夠分析經(jīng)特異抗原活化后分泌細胞因子[如干擾素-γ(interferongamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等]的單個效應(yīng)細胞的頻數(shù),具有敏感、特異、易于重復的優(yōu)點[1],是檢測抗原反應(yīng)性效應(yīng)細胞的最可靠實驗方法之一[2],目前已成為抗原特異性T細胞免疫學研究的主流技術(shù)。本文就ELISPOT技術(shù)作如下綜述。

1 ELISPOT技術(shù)的基本原理

ELISPOT培養(yǎng)板以二氟化樹脂(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜等為基質(zhì),包被上特異性單克隆抗體,在培養(yǎng)板孔內(nèi)加入細胞培養(yǎng)基、待檢測的細胞及抗原刺激物進行培養(yǎng)。在特異性抗原或非特異性有絲分裂原的刺激下,T細胞分泌各種細胞因子,細胞因子被膜上的單克隆抗體捕獲。被捕獲的細胞因子可以與生物素標記的第二抗體結(jié)合,然后用酶標親和素與生物素進行化學酶聯(lián)顯色,在膜的局部形成一個個圓形斑點[3]。

2 ELISPOT技術(shù)的優(yōu)點

ELISPOT技術(shù)得到廣泛應(yīng)用,首先是由于其在檢測抗原特異性細胞低頻數(shù)時的高敏感性,比以流式細胞術(shù)為基礎(chǔ)的技術(shù)(四聚體和細胞內(nèi)細胞因子染色)的敏感性要高1～2個數(shù)量級;其次,ELISPOT技術(shù)可以利用凍存的外周血單個核細胞(peripheral b lood mononuclear cells,PBMC)樣本來進行免疫監(jiān)測分析而不喪失細胞的重要活性[4],同時計算機輔助圖像分析系統(tǒng)的使用也使大規(guī)模研究成為可能。

3 ELISPOT技術(shù)的分析方法

由于IFN-γ分泌量較多,且與T細胞的細胞毒功能密切相關(guān),使IFN-γ的ELISPOT技術(shù)分析得到了廣泛應(yīng)用[5]。但是,單獨檢測IFN-γ不足以充分反映T細胞的免疫功能,同時檢測多種細胞因子的需求使雙色ELISPOT、熒光ELISPOT及Granzyme B ELISPOT等分析方法相繼出現(xiàn)[6-8]。但這些方法還需進一步完善,雖然早已有雙色ELISPOT技術(shù)應(yīng)用的報道,但一些原因卻限制了其廣泛使用。(1)當ELISPOT板包被時,2種捕獲抗體競爭結(jié)合到膜表面,抗體的疏水性決定它們結(jié)合到膜上的親活力,如果1種抗體具有更強的親水性,它將喪失競爭力;(2)底物產(chǎn)生的2種顏色必須各自獨立形成,不能相互干擾,且都不能處于優(yōu)勢地位,這樣產(chǎn)生2種細胞因子的細胞才能被檢測出來;(3)圖像分析系統(tǒng)也必須建立起來,并通過驗證能準確客觀地測量每個斑點的顏色和形態(tài);(4)細胞因子的產(chǎn)量還受反饋機制調(diào)節(jié)。因此,需要明確哪些細胞因子結(jié)合可以在雙色ELISPOT技術(shù)中進行檢測。Quast等[9]發(fā)現(xiàn)白介素2(interleukin-2,IL-2)可導致IFN-γ和IL-5斑點的丟失。熒光ELISPOT技術(shù)檢測時由于熒光素直接偶聯(lián)在抗體或親和素上,缺乏酶催化底物的放大作用,靈敏度無法與化學顯色的ELISPOT技術(shù)方法比較。此外硝酸纖維素膜和PVDF膜有自發(fā)熒光現(xiàn)象,導致背景升高,信噪比下降[10]。

4 ELISPOT技術(shù)的標準化與驗證

由于超高的靈敏度,ELISPOT結(jié)果易受到諸多因素影響,所以,需要進行ELISPOT技術(shù)的標準化與驗證[11]。

4.1 ELISPOT技術(shù)的標準化

4.1.1 ELISPOT板 Schielen等[12]首先將PVDF膜應(yīng)用到ELISPOT技術(shù),后來隨著ELISPOT-免疫沉淀反應(yīng)(immunop recipitation,IP)及高通量篩選(high-throughput screening,HTS)等板材的應(yīng)用,質(zhì)量得到進一步的提高。塑料ELISA板蛋白結(jié)合能力有限,所以不建議使用。建議在一項研究中使用同一種板材,最好為同一批次,同時需要檢查生產(chǎn)廠家的質(zhì)量控制程序,批次性能以及是否達到生物分子篩查協(xié)會(society for biomolecu lar sciences,SBS)制定的標準。

4.1.2 包被規(guī)程 使用PVDF膜板,預濕時每孔加入70%乙醇15μL以降低膜的疏水性。但乙醇必須被充分洗掉,殘留乙醇能干擾斑點形成。成對抗體的選擇根據(jù)實驗要求而定,需要考慮抗體敏感性因素。不同商品試劑盒檢測相同細胞因子的敏感性可相差10倍,所以需要進行標準化,其中的一個重要參數(shù)是包被抗體的總量,一般認為每孔約0.5～1.0μg包被抗體可以得到理想的斑點。

4.1.3 細胞準備 (1)細胞分離:因為紅細胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影響T細胞功能,所以,必需進行PBMC的分離。(2)凍存、貯藏和運輸:凍存在細胞處理過程中最為關(guān)鍵。細胞的凍存有多種方法,自動控制降溫器可以提供逐步智能降溫,這在細胞最佳凍存及其標準化程序中是必需的;經(jīng)濟實用的方法是使用裝有異丙醇的凍存盒。血液樣本處理,分離及凍存的最佳時間范圍應(yīng)該在8 h內(nèi)或在采集當天完成,樣本放置時間過長或在不合適的溫度下過久,會影響PBMC的功能,甚至可造成IFN-γ斑點形成細胞減少5倍以上。運輸PBMC的最佳方式是專用的冷凍液氮裝置,液氮緩慢揮發(fā)使氣態(tài)氮充滿運輸容器,使樣本可在接近-140℃的恒定溫度下保持10～18 d。不斷變化的溫度會對細胞功能造成致命影響,不推薦用干冰運輸盒運送標本。(3)細胞復蘇:細胞復蘇時應(yīng)用DNA酶能提高細胞的產(chǎn)量并降低細胞團塊形成[13],ELISPOT技術(shù)分析前最好將PBMC放置過夜,使有凋亡傾向的細胞死亡,這樣在分析前就可以估計出活力細胞的確切計數(shù)[14]。

4.1.4 刺激抗原 重組蛋白可以用來檢測CD4+T細胞介導的反應(yīng),對CD8+T細胞介導的反應(yīng)有限。對重組蛋白的反應(yīng)依賴于抗原呈遞細胞(antigen-p resenting cell,APC),APC細胞在凍存后數(shù)量減少,同時重組蛋白在不同貯藏溫度下會出現(xiàn)溶解性和穩(wěn)定性的問題。活的重組病毒載體或病毒感染細胞株也有相似的優(yōu)缺點。重疊多肽池能用來鑒定CD4+和CD8+T細胞識別的最佳表位。肽段越短,重疊越多,鑒別組織相容性復合體(major histocompatibility complex,M HC)-Ⅰ表位時越精確,而不需要考慮可能的MHC-Ⅱ類反應(yīng),因為MHC-Ⅱ表位的氨基酸序列長度相對較長。所以檢測 MHC-Ⅰ表位(CD8+T細胞反應(yīng))、MHC-Ⅱ表位(CD4+T細胞反應(yīng))時在考慮合成肽價格的同時需要找到一個理想的平衡點。另外使用多肽時需要注意多肽的純度,以降低非特異細胞因子的產(chǎn)生。

4.1.5 細胞計數(shù) ELISPOT技術(shù)在細胞數(shù)量上需要很高的準確性,同時最小化死細胞數(shù)量也很重要,死細胞可影響分析的正確性。常用臺盼藍排斥試驗和對絲裂原的反應(yīng)來判斷復蘇后PBMC的質(zhì)量。但Sm ith等[15]試驗表明檢測細胞的凋亡在判斷細胞活力方面更有效,當?shù)蛲鲂∮?8%時可以得到理想結(jié)果。目前已有自動化設(shè)備用來進行細胞計數(shù)以及細胞活力檢測。

4.1.6 洗滌及斑點形成 洗滌程序可以采用手工,也可以使用自動洗板機。大批量洗滌時,手工需要很長時間,從而造成孵育時間不一致。另外,手工洗滌時,如果緩沖液過少或壓力過低就不能完全移除細胞和試劑,從而造成膜上的假相斑點增多以及孔的周邊顏料聚集。因此,建議使用自動洗板機,它至少可以使用2種不同的洗滌緩沖液,且能調(diào)整清洗探針的高度和緩沖液的流量。斑點的形成與ELISA相似,正確的成對抗體及其濃度必須通過實驗驗證后加以選擇,最佳的抗體量需要參考生產(chǎn)廠家的要求。對于親和素酶復合物也必須給予重視,不同批次間的酶變異性要小,以保證實驗的可比性。底物的選擇能夠影響斑點的檢測數(shù)量,針對同一種酶的不同底物以及不同廠家生產(chǎn)的同一底物可能在敏感性上不同,從而造成斑點計數(shù)產(chǎn)生相當大的差別[16]。

4.1.7 ELISPOT板判讀 使用顯微鏡計數(shù)斑點的方法費時、費力,結(jié)果依賴個人經(jīng)驗,產(chǎn)生偏差和較大變異的問題不可避免。使用自動讀板機可明顯降低計數(shù)時的變異性[17]。Currier等[18]使用自動讀板機時通過23個 8～11肽組成的肽池[雞胚成纖維細胞(chickenembryo fibrob last,CEF)肽池]來確定斑點的參數(shù)設(shè)置標準,它們可以被CD8+T細胞識別并被Ⅰ類人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,H LA)-A和H LA-B等位基因呈遞,形成的斑點代表記憶性CD8+T細胞反應(yīng)。Janetzki等[19]實驗表明使用CEF肽池的控制方法時預設(shè)讀板參數(shù)能獲得變異性更小的結(jié)果。

4.2 ELISPOT技術(shù)的驗證 ELISPOT技術(shù)的驗證必須在開始臨床試驗前進行,驗證時應(yīng)首先確定分析中可能出現(xiàn)問題的變量(如:孵育時間、試劑純度及試劑濃度等),并隨后在國際協(xié)調(diào)會議(international conference on harmonisation,ICH)文件ICH-Q2A和ICH-Q2B的指導下對整個操作規(guī)程進行驗證。針對一個標準作業(yè)程序(standard operation procedure,SOP)的驗證過程應(yīng)該包括:準確性、精確性、特異性、檢出限界、定量限界、線性及檢測范圍。

5 ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用展望

ELISPOT技術(shù)目前得到了廣泛的應(yīng)用,其涉及范圍包括:A IDS、癌癥、自身免疫性疾病、過敏性疾病以及移植方面的研究;感染性疾病的免疫監(jiān)測;疫苗的研發(fā)與檢測;免疫顯性表位的鑒定等[20-25]。ELISPOT技術(shù)在醫(yī)學研究方面所受的限制不在于技術(shù)本身,而在于人們的想象力與創(chuàng)新思維,客觀地說,在一切免疫學研究的前沿領(lǐng)域,ELISPOT技術(shù)都是最有力的研究工具之一。

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