宋軍科，才學鵬，駱學農(nóng)，林 青，竇永喜，于三科＊

（1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅蘭州 730046）

半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CP）約為21ku～30ku，在pH 4～6.5時水解活性最高［1］。CP在生物進化過程中是非常保守的酶系，不同的生物物種之間的半胱氨酸蛋白酶有一定的相似性，同一物種的不同半胱氨酸蛋白酶也有結(jié)構(gòu)相似的現(xiàn)象，這些結(jié)構(gòu)特點相似的酶構(gòu)成了一個蛋白酶家族，稱之為caspase（cysteine aspartic acic specific protease）家族。在1879年第一個純化和確認的半胱氨酸蛋白酶取自番木瓜果（carica papaya），因而命名為木瓜蛋白酶（papain）。以后發(fā)現(xiàn)許多與木瓜蛋白酶有相似序列的蛋白酶，統(tǒng)稱為木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain like protease）或CA蛋白酶族。寄生蟲半胱氨酸蛋白酶大多屬于CA族內(nèi)的C1族（組織蛋白酶B cathepsin B和組織蛋白酶L樣蛋白酶cathepsin L－like）和C2族（鈣激活蛋白酶樣蛋白酶）［2］。長期以來，對CP的種類、來源、結(jié)構(gòu)及其功能進行了多方面的研究，已經(jīng)認識到其廣泛分布于從病毒至脊椎動物的生物體中，當然動物和人的寄生蟲也會不例外，這些蛋白酶已經(jīng)被證實在寄生蟲的發(fā)育和生存過程中發(fā)揮著各種各樣重要的作用。經(jīng)過許多科研工作者過去幾十年在寄生性蠕蟲和原蟲方面的研究，揭示了這些由寄生蟲分泌的蛋白酶不僅是寄生蟲入侵組織的因子之一，其也可能在寄生蟲營養(yǎng)、免疫逃避和蛻皮等方面有重要作用［3－5］。因此，寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶已經(jīng)在研發(fā)新的抗寄生蟲藥物和抗寄生蟲疫苗的目標方面得到了關(guān)注。

1 寄生蟲半胱氨酸的來源及存在的部位

在寄生生物中存在有分泌的蛋白水解酶，說明這些酶對于寄生蟲進行各種必需的機制是非常需要的。組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶已經(jīng)在很多種寄生蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，而且組織蛋白酶L在寄生蟲的所有發(fā)育階段都會被分泌。寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的分泌或存在的部位在不同蟲種以及同一蟲種不同蟲期均有差異。肝片吸蟲，衛(wèi)氏并殖吸蟲的半胱氨酸蛋白酶在腸上皮細胞中合成，集中于分泌小泡，通過分泌小泡釋放到腸腔中［6－7］。巴西日本圓線蟲的半胱氨酸蛋白酶活性不僅存在于蟲體抽提物中，也存在于其排泄分泌物中。曼氏血吸蟲的組織蛋白酶B和L1樣半胱氮酸蛋白酶存在于成蟲皮層（尤其是雄蟲的腹側(cè)皮層）和盲腸的腸表皮細胞［8］。瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶存在于胞內(nèi)酸性食物泡中［9］。

寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲的多個部位及各個發(fā)育階段均可產(chǎn)生或存在，目前研究人員所獲得的半胱氨酸蛋白酶來源一方面來自于蟲體組織提取物或分泌代謝產(chǎn)物，而另一方面則應用分子生物學方法通過對半胱氨酸蛋白酶的基因進行克隆，表達而獲得。

2 半胱氨酸蛋白酶的分泌機制

許多感染哺乳動物宿主的單細胞寄生蟲和多細胞寄生蟲產(chǎn)生多種蛋白酶，其中一些是通過分泌方式產(chǎn)生的。組織蛋白酶L在寄生蟲的所有發(fā)育階段都會被分泌，片形吸蟲排泄分泌物（excretion／secretion，E／S）的一個重要組成部分就是有一類半胱氨酸蛋白酶，它們的分子量大小在26ku～30ku之間，這些酶通過吸蟲成蟲和幼蟲的腸表皮分泌。免疫細胞化學研究說明這種酶被做為無活性的前酶—前組織蛋白酶L貯存于腸表皮上皮細胞中，再通過自身催化前組織蛋白酶L表現(xiàn)出活性，然后分泌到寄生蟲腸內(nèi)腔中的酸性環(huán)境中，在此有活性的蛋白酶起到消化食物的功能［10］。由于寄生性吸蟲的腸管為盲腸，因此，未消化產(chǎn)物靠回流到口孔（約每3h一次）排出。通過這種方式，有活性的成熟組織蛋白酶L被定期地釋放出來，以充分發(fā)揮其作用。組織蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶在吸蟲成蟲體內(nèi)被大量合成（每成蟲每小時0.5μg／～1.0μg），從分泌小泡內(nèi)物質(zhì)的合成到釋放到腸內(nèi)腔中的更新率是非?？斓模蠹s每小時一次［11］。

3 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲免疫逃避、營養(yǎng)獲得與移行方面的研究

3.1 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲免疫逃避中的作用

當研究發(fā)現(xiàn)肝片吸蟲E／S產(chǎn)物能將IgG重鏈切割的用作以后，人們認識和預測到組織蛋白酶在宿主免疫免疫逃避中的作用。認為這些酶可能會阻止抗體活性效應功能，比如可以阻止補體結(jié)合在移行中的吸蟲附近，為蟲體免受免疫攻擊提供保護。體外試驗也證實了嗜酸性粒細胞不能進行或者不能維持抗體介導對幼蟲階段包囊的結(jié)合能力，寄生蟲在體內(nèi)分泌的這些酶可以保護它們免受宿主免疫反應的破壞。另一方面，寄生蟲通過自身分泌的蛋白酶加速其皮層和組織的更新與代謝以阻止宿主免疫系統(tǒng)的識別［12］。另外，一些寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶也發(fā)現(xiàn)有通過誘導IL－4抑制Th1免疫的作用。Machado D C等［13］證明了這些蛋白酶甚至在沒有特異性免疫球蛋白存在的情況下，也可活化肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒并分泌IL－4。缺乏半胱氨酸蛋白酶的墨西哥利什曼原蟲能在Balb／c小鼠體內(nèi)誘導Th1免疫反應，小鼠也很少遭受感染，且不能使小鼠生長受到損害［14］。片形吸蟲在牛、羊和人等許多宿主體內(nèi)可導致一種慢性肝病。與其他寄生蟲一樣，肝片吸蟲產(chǎn)生一種嚴重的Th2反應，并且能抵御宿主免疫反應的持續(xù)攻擊，在它的終末宿主體內(nèi)長時間存活［10］。

片形吸蟲感染過程期間，在哺乳動物宿主體內(nèi)發(fā)育的寄生蟲的所有階段中都有組織蛋白酶L的釋放，其中穿過腸壁的新感染的包囊幼蟲階段也可釋放此蛋白酶［15］。目前研究認為，肝片吸蟲通過利用誘導的半胱氨酸蛋白酶對CD4進行切割，這可能是肝片吸蟲用來抑制淋巴細胞增殖的機制之一，這種機制在綿羊體內(nèi)有助于蟲體逃避對宿主的免疫系統(tǒng)并有助于感染的建立。已經(jīng)證實了肝片吸蟲的感染能抑制 Th1反應［10］。

3.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲獲取營養(yǎng)與移行中的作用

從宿主組織降解開始，攝食與移行可能就不會被分開，在寄生蟲移行期間，宿主組織降解物能提供給寄生蟲用以更進一步消化和吸收的物質(zhì)。半胱氨酸蛋白酶主要的生化性質(zhì)還是其蛋白水解作用。正是因為這個性質(zhì)，使得該酶成為某些寄生蟲的主要“消化酶”。有人通過捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的體外培養(yǎng)試驗，表明了該蟲體分泌的半胱氨酸蛋白酶可抑制綿羊紅細胞的凝集，水解血紅蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白和IgG，而半胱氨酸蛋白酶對IgG的水解主要是作用于絞鏈區(qū)使其降解［16］。從衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴純化出的酸性半胱氨酸蛋白酶能降解人血清白蛋白、免疫球蛋白、補體成分等多種人體蛋白質(zhì)［17］。在曼氏血吸蟲中，在盲腸內(nèi)壁的腸表皮細胞中發(fā)現(xiàn)了一種組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶，此酶可能涉及白蛋白和血紅蛋白的降解，以此作為血吸蟲童蟲的主要營養(yǎng)來源［4，18］。而有棘顎口線蟲組織蛋白酶 L1（Gnathostomaspinigerumcathepsin L1，GsCL1）在腸中的定位，說明了此蛋白酶對有棘顎口線蟲三期幼蟲（L3）攝入的宿主蛋白有降解作用［19］。

半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲侵入宿主的過程中也起著重要的作用。通過捻轉(zhuǎn)血矛線蟲對結(jié)締組織降解能力的研究，發(fā)現(xiàn)該蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶能夠降解結(jié)締組織的主要成分，而對宿主結(jié)締組織的降解有利于對宿主組織的破壞和易于蟲體的侵入［20］。肝片吸蟲組織蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶2（Fasciolahepaticacathepsin L cysteine proteinases，F(xiàn)hCL－2）以產(chǎn)生一種纖維蛋白凝塊的方式切割纖維蛋白原［21］。Berasain P等［22］證明了 FhCL－1和FhCL－2能降解細胞外基質(zhì)和基底膜分子以促進寄生蟲自身移行。

4 其他方面

4.1 半胱氨酸蛋白酶對寄生蟲生殖力的影響

一種組織蛋白酶被免疫定位于肝片吸蟲成蟲的梅氏腺中［23］。梅氏腺是一簇細胞，它們能夠分泌催化蟲卵卵殼的形成。用4.8mg的E／S產(chǎn)物（含1300μg半胱氨酸蛋白酶）免疫水牛后，證明了在糞便中的大片吸蟲蟲卵數(shù)明顯下降［10］。因此，推測接種后的水牛體內(nèi)，梅氏腺半胱氨酸蛋白酶L是免疫反應的目標，它可導致卵殼合成受到干擾。對吸蟲自身生殖的影響，可依次對從終末宿主到中間宿主的傳播各環(huán)節(jié)施加影響。

4.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲脫包囊、脫鞘和羽化中的作用

原蟲、蠕蟲和節(jié)肢動物的羽化，包囊破裂，甚至包囊形成都需要半胱氨酸蛋白酶的參與。在衛(wèi)氏并殖吸蟲中，半胱氨酸蛋白酶涉及宿主腸腔內(nèi)囊蚴的脫囊。L3期美洲板口線蟲脫鞘和曼氏血吸蟲蟲卵孵化都需要半胱氨酸蛋白酶，盤尾絲蟲、犬惡絲蟲和彭亨絲蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑阻滯L3幼蟲期蛻皮。研究發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲滋養(yǎng)體（或裂殖體）的可溶性胞體提取物中的半胱氨酸蛋白酶能夠從人紅細胞膜錨蛋白的C端裂解掉一個155ku肽段，而錨蛋白是紅細胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，高親和性連接于紅細胞定形素—肌動蛋白，形成膜骨架網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。降解后的錨蛋白與細胞膜的連接減弱，從而降低了紅細胞膜骨架的穩(wěn)定性，使其脆性增加，有利于蟲體的人侵和釋放。此前也有人從伯氏瘧原蟲裂殖體和裂殖子的頂端復合體中鑒定出了68ku的半朧氨酸蛋白酶，該酶可能在蟲體的人侵中具有一定作用。

這些情況說明了半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲的發(fā)育過程中是有重要的作用。

4.3 半胱氨酸蛋白酶的免疫原性

半胱氨酸蛋白酶在不同的蟲種和同一蟲種不同期，其化學結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量和性質(zhì)都不盡相同，其免疫原性也存在著種特異性和期特異性。從肝片吸蟲成蟲排泄分泌物中純化出兩種半胱氨酸蛋白酶（Fasl和Fas2），經(jīng)試驗分析顯示它們是免疫優(yōu)勢抗原，可被肝片吸蟲病患者血清識別，敏感性和特異性均較高［20］。曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴分泌的半胱氨酸蛋白酶（分子質(zhì)量分別為21，27和53ku）能夠引起宿主特異性IgE抗體反應。由此可見，寄生蟲半胱氨酸蛋白酶具有較強的免疫原性。利用此免疫原性，可將半胱氨酸蛋白酶用于寄生蟲病的免疫診斷和疫苗的研制［24，25］。

5 展望

目前隨著對半胱氨酸蛋白酶的發(fā)現(xiàn)以及其結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，寄生蟲的半胱氨酸蛋白酶也受到越來越多的學者關(guān)注。對它的研究不僅揭開了寄生蟲與宿主相互作用的機制，也給寄生蟲病的診斷與防治開辟了新的思路，給目前化學治療所引起的越來越嚴重的耐藥性問題的解決帶來了希望。如將半胱氨酸蛋白酶作為治療寄生蟲化學治療的新靶點，利用相應的特異性抑制物來抑制寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的活性，阻斷寄生蟲的營養(yǎng)、免疫逃避、侵入及對宿主的損害作用，從而達到治療寄生蟲病的目的，在這個領(lǐng)域已經(jīng)開展了許多相關(guān)的研究。相信今后半胱氨酸蛋白酶將會得到更加廣泛的研究和應用。

［1］Grzonka Z，Jankowska E，Kasprzykowski F，et a1.Structural studies of cysteine proteaseand their inhibitors［J］.Acta Biochim Pol，2001，48：1－20.

［2］Kang J M，Bahk Y Y，Cho P Y，et al.A family of cathepsin F cysteine proteases ofClonorchissinensisis the major secreted proteins that are expressed in the intestine of the parasite［J］.Mol Biochem Parasitol，2009，170（1）：7－16.

［3］Park H，Kim S I，Hong K M，et al.Characterization and classi－fication of five cysteine proteinases expressed byParagonimuswestermaniadult worm ［J］.Exp Parasitol，2002，102（3－4）：143－149.

［4］Estrela A，Seixas A，Termignoni C.A cysteine endopeptidase from tick（Rhipicephalus（Boophilus）microplus）larvae with vitellin digestion activity ［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2007，148（4）：410－416.

［5］Guiliano D B，Hong X，McKerrow J H，et al.A gene family of cathepsin L－like proteases of filarial nematodes are associated with larval molting and cuticle and eggshell remodeling ［J］.Mol Biochem Parasitol，2004，136：227－242.

［6］Pinlaor P，Kaewpitoon N，Laha T，et al.Cathepsin F cysteine protease of the human liver fluke，Opisthorchisviverrini［J］.PLoS Negl Trop Dis，2009，3（3）：e398.

［7］言 慧.衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲半胱氨酸蛋白酶基因的克隆與表達［J］.國外醫(yī)學：寄生蟲病分冊，2002，29：84.

［8］Brady C P，Dowd A J，Brindley P J，et al.Recombinant expression and localization of Schistosoma mansoni cathepsin L1 support its role in the degradation of host hemoglobin［J］.Inf and Immunity，1999，67（1）：368－374.

［9］Gluzman I Y，F(xiàn)rancis S E，Oksman A，et al.Order and specificity of thePlasmodiumfalciparumhemoglobin degradation pathway［J］.J Clin Invest，1994，93：1602－1608.

［10］Dixita A K，Dixitb P，Sharmac R L.Immunodiagnostic／protective role of cathepsin L cysteine proteinases secreted byFasciolaspecies［J］.Vet Parasitol，2008，154：177－184.

［11］Collins P R，Stack C N，O＇Neill S M，et al.Cathepsin L1，the major protease involved in liver fluke（Fasciolahepatica）virulence［J］.J Biol Chem，2004，279：17038－17046.

［12］McKerrow J H，Caffrey C，Kelly B，et al.Proteases in parasitic diseases［J］.Annu Rev Pathol，2006，1：497－536.

［13］Machado D C，Horton D，Harrop R，et al.Potential aller－gens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen－specific IgE［J］.Eur J Immunol，1996，26：2972－2980.

［14］Alexander J，Coombs G H，Mottram J C，et al.Leishmania mexicanacysteine proteinase－deficient mutants have attenuated virulence for mice and potentiate a Th1response［J］.J Immunol，1998，161：6794－6801.

［15］Harmsen M M，Cornelissen J B W J，Buijs H E，et al.Identification of a novelFasciolahepaticacathepsin L protease containing protective epitopes within the propeptide［J］.Int J Parasitol，2004，34：675－682.

［16］王英.半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲與宿主的相互關(guān)系中的作用［J］.國外醫(yī)學：寄生蟲學分冊，2001，28（4）：145－149.

［17］Park H，Kim S I，Hong K M，et al.Characterization and classification of five cysteine proteinases expressed byParagonimuswestermaniadult worm ［J］.Exp Parasitol，2002，102（3－4）：143－149.

［18］Dahl E L，Rosenthal P J.Biosynthesis，localization and processing of falcipain cysteine proteases ofPlasmodiumfalciparum［J］.Mol Biochem Parasitol，2005，139：205－212.

［19］Natthawan K，Pichart U，Nimit M，et al.Identification and characterization of a cathepsin L－like cysteine protease fromGnathostomaspinigerum［J］.Mol Biochem Parasitol，2008，160（2）：129－137.

［20］Na B K，Kim S H，Lee E G，et al.Critical roles for excretory secretory cysteine proteases during tissue invasion ofParagonimuswestermaninewly excysted metacercariae［J］.Cell Microbiol，2006，8：1034－1046.

［21］Dowd A J，McGonigle S，Dalton J P，et al.Fasciolahepaticacathepsin L cleaves fibrinogen and produces a novel type of fibrinogen clot［J］.Eur J Biochem，1995，232：241－246.

［22］Berasain P，Goni F，McGonigle S，et al.Proteinases secreted byFasciolahepaticadegrade extracellular matrix and basement membrane components［J］.J Parasitol，1997，83：1－5.

［23］Wijffles G L，Salvatore L，Dosen M，et al.Vaccination of sheep with purified cysteine proteinases ofFasciolahepaticadecreases worm fecundity［J］.Exp Parasitol，1994，78：132－148.

［24］Dowd A J，Tort J，Roche L，et al.Isolation of a cDNA encodingFasciolahepaticacathepsin L and functional expression inSaccharomycescerevisiae［J］.Mol Biochem Parasitol，1997，88：163－174.

［25］McManus D P，Dalton J P.Vaccines against the zoonotic trematodesSchistosomajaponicum，F(xiàn)asciolahepaticaandFasciolagigantica［J］.2006，133：S43－S46.