鮑艷芳 應(yīng)素芬 何斐 泮瑛瑛 張偉 徐靈芝

近來研究發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)（ECM）并不只是細胞的支架，它還能動態(tài)調(diào)節(jié)各種細胞的功能和行為。ECM能結(jié)合生長因子、細胞因子、化學(xué)因子和細胞外酶，并調(diào)節(jié)它們的生物利用度和活性。此外，ECM蛋白可以直接和細胞表面受體作用，激發(fā)信號通路，從而調(diào)節(jié)各種細胞功能。ECM蛋白中有一種基質(zhì)細胞蛋白（matricellular proteins），呈動態(tài)表達，但無明顯的結(jié)構(gòu)作用，主要調(diào)節(jié)細胞對環(huán)境刺激的反應(yīng)。已知的基質(zhì)細胞蛋白有血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondins），富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、hevin、骨橋蛋白（osteopontin）、結(jié)合腕蛋白（tenascin）C和X以及CCN家族成員。最近研究顯示，CCN蛋白是胚胎發(fā)育所必需的調(diào)節(jié)因子，并在炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)、纖維性疾病和腫瘤中有重要作用。

最早發(fā)現(xiàn)的3個成員分別是CYR61、CTGF和NOV。由于CCN蛋白有很多名字，為減少不同名稱造成的混亂，國際上按最早發(fā)現(xiàn)的3個成員的首字母縮寫將其命名為CCN1-6。他們是脊椎動物中富含半胱氨酸的6個同源蛋白，有共同的結(jié)構(gòu)模式，氨基端分泌肽后面緊接著4個保守的結(jié)構(gòu)域，序列上分別和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）、von Willebrand因子C型重復(fù)（vWC）、血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)（TSP）和含半胱氨酸結(jié)基序的羧基末端結(jié)構(gòu)域（CT）相似。每個結(jié)構(gòu)模塊都是由保守的獨立外顯子編碼，提示CCN基因是外顯子改組的產(chǎn)物。蛋白中間有一個鉸鏈結(jié)構(gòu)，對蛋白水解特別敏感[1]?？赡苡捎诎腚装彼釟埢亢芨?0～10%)，目前很難提取有生物活性的純CCN蛋白。難以獲得高質(zhì)量的純CCN蛋白以及對其生物活性和功能評價缺乏一個統(tǒng)一標準是阻礙研究進展的重要原因。由于蛋白制備方法不同，各個實驗室結(jié)果可能存在不一致。對CCN功能的研究使得人們對ECM功能有更多的認識。

1 CCN蛋白的細胞受體和其調(diào)控的細胞功能

1.1 CCN蛋白的細胞受體

關(guān)于CCN蛋白的細胞受體目前比較明確的觀點有：（1）CCN蛋白主要和包括整合素、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)在內(nèi)的細胞粘附受體結(jié)合而發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)CCN功能的整合素至少包括α2β1、α5β1、α6β1、αvβ5、αIIbβ3、αMβ2和αDβ2。在某些條件下HSPGs作為整合素的輔助受體，與CCN之間也有強相互作用。（2）脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRPs)等一般情況下不和ECM蛋白結(jié)合的受體也能和CCN結(jié)合。（3）CCN和不同的整合素結(jié)合取決于目標細胞類型和介導(dǎo)的功能。（4）CCN蛋白上不同的整合素結(jié)合位點既可以相互協(xié)同，又可以獨立完成不同的細胞效應(yīng)。

1.2 細胞粘附、遷移和DNA合成

作為細胞粘附蛋白是CCN家族最顯著和一致的功能。細胞在體外培養(yǎng)時貼壁生長，CCN蛋白和整合素以及與HSPGs結(jié)合啟動粘附信號通路從而支持大多數(shù)粘附細胞的粘附。CCN蛋白還能作為橋接蛋白促進細胞粘附到其他ECM蛋白。CCN蛋白的另外一個獨特功能是調(diào)節(jié)細胞遷移。CCN1、CCN2和CCN3蛋白可以促進很多干細胞遷移，但是過表達的CCN4和CCN5卻抑制細胞遷移。CCN1、CCN2及CCN3都是微血管內(nèi)皮細胞的化學(xué)趨化劑，這點與它們促血管生成作用是一致的。CCN2還有化學(xué)激動劑的作用。

CCN蛋白促有絲分裂的作用似乎取決于細胞類型。盡管CCN2能促進軟骨細胞和成骨細胞的DNA合成[2]，但它是否能促進纖維母細胞的有絲分裂還是有爭議的。早期研究認為CCN2能促進纖維母細胞的有絲分裂，然而其他研究顯示CCN1、CCN2和CCN3單獨作用時本身沒有促進有絲分裂的能力，但是可以通過整合素αvβ3增強其他促有絲分裂生長因子的DNA合成作用。與此相反的是CCN5缺乏CT結(jié)構(gòu)域，它的作用是抑制細胞增殖。

1.3 細胞生存和凋亡

很多細胞粘附到ECM會促進其生存，而脫離ECM則很快發(fā)生細胞死亡。因此CCN蛋白和不同細胞及不同整合素作用，既能促進細胞生存又能誘導(dǎo)凋亡，提示其可能在組織塑形中發(fā)揮作用。

1.4 血管發(fā)生

CCN1、CCN2和CCN3直接和整合素αvβ3結(jié)合促進內(nèi)皮細胞粘附、遷移、增生和小管形成從而促進血管生成。CCN1促進整合素依賴的CD34+前體細胞招募而增強內(nèi)皮細胞的增生和新生血管生成[3]，與此一致的是CCN1敲除小鼠有心臟缺陷。除了直接作用，CCN還能調(diào)節(jié)VEGF-A、VEGF-C等促血管生成因子的表達和活性[1]。CCN蛋白在胚胎發(fā)育、炎癥和腫瘤發(fā)生中有重要作用，可能部分和其促血管生成作用有關(guān)[4]。

1.5 軟骨和骨發(fā)生

動物模型和細胞培養(yǎng)實驗顯示CCN蛋白對骨形成有正負雙向調(diào)節(jié)作用。CCN1促進成骨細胞分化抑制破骨細胞，提示在骨發(fā)生上有雙向調(diào)節(jié)作用[5]。體外培養(yǎng)中CCN2可以促進原代成骨細胞的增殖和分化，小鼠實驗中CCN2過表達則抑制成骨細胞功能從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[6]。

1.6 CCN蛋白和生長因子及細胞因子之間的相互作用及功能

通過功能性和/或物理性相互作用，CCN蛋白可以改變某些生長因子和細胞因子的作用。CCN蛋白可以改變TNFα在炎癥反應(yīng)中的作用。CCN1生物效應(yīng)的發(fā)揮需多種受體參與，細胞上的受體可能決定了哪些細胞將被清除。CCN蛋白也可以調(diào)節(jié)生長因子的生物利用度和信號通路。CCN能促進和增強TGF-β功能，卻抑制BMP的功能。

1.7 生長因子、激素和環(huán)境刺激調(diào)節(jié)CCN基因表達

CCN基因的表達受到各種環(huán)境刺激的影響，包括生長因子、激素、細胞因子、缺氧、UV和機械應(yīng)力。這些基因?qū)υS多促有絲分裂信號和外部刺激高度敏感，包括成纖維生長因子、血小板衍化生長因子、佛波醇酯類和cAMP。TGF-β能強烈調(diào)控CCN基因表達，包括激活CCN1、CCN2、CCN4和CCN5的轉(zhuǎn)錄，抑制CCN3的表達。最近報道了一個新的調(diào)控機制，軟骨細胞中基質(zhì)金屬酶MMP3和一個CCN2增強子結(jié)合能增強其表達，可能是通過轉(zhuǎn)錄子起作用[7]。MMP3在細胞內(nèi)協(xié)同TGF-β激活CCN2啟動子，提示MMP3和SMAD信號通路之間有相互作用。

一些激素也上調(diào)CCN表達。體外實驗中血管緊張素Ⅱ增強VSMCs或鼠主動脈中CCN1的表達(Hilfiker et al，2002)。內(nèi)皮素能上調(diào)成纖維細胞、VSMCs和心肌細胞CCN2的表達，與他們在纖維化疾病和心肌中的功能一致。CCN基因?qū)Νh(huán)境刺激很敏感。暴露到紫外線下就可以誘導(dǎo)CCN1表達。低氧條件下在缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)作用下可以誘導(dǎo)CCN和CCN2表達。HIF-1α和c-Jun/AP-1作用從而有助于CCN1在缺氧條件下的轉(zhuǎn)錄。對于CCN2，HIF-1α依賴的轉(zhuǎn)錄和通過3′UTR的一個序列元件增強mRNA穩(wěn)定性均有利于缺氧狀態(tài)下的CCN2的表達。機械刺激也能誘導(dǎo)CCN基因表達。成纖維細胞，軟骨細胞和VSMCs在張力和壓力作用下，內(nèi)皮細胞在血流動力作用下，腎小球系膜細胞在靜水壓作用下均能快速表達CCN1和CCN2。應(yīng)力能上調(diào)心肌和骨骼肌中CCN1和CCN2的表達[8]。在人體研究中發(fā)現(xiàn)，一次強力鍛煉后機械應(yīng)力能誘導(dǎo)骨骼肌表達CCN1和CCN2[8]。炎癥和組織損傷也能誘導(dǎo)CCN表達。在出生后的發(fā)育和正常人體組織中，CCN蛋白通常都是低水平表達的，但是在炎癥和損傷修復(fù)中表達升高。IL-1和TNFα等炎癥細胞因子誘導(dǎo)CCN表達[9]，細菌和病毒感染也能誘導(dǎo)其表達[10]。

1.8 CCN蛋白在胚胎發(fā)育中的作用

敲除CCN1、CCN2、CCN3和CCN6等目標基因的小鼠模型都已經(jīng)建立。除了CCN6敲除小鼠沒有明顯表型改變外，其他敲除小鼠的表型改變說明CCN在心血管和骨骼發(fā)育中有重要作用。敲除CCN1的小鼠在胚胎發(fā)育中出現(xiàn)致命的心血管畸形。CCN1敲除小鼠在發(fā)育的早期就死亡了，盡管胚胎死亡時還沒明顯的骨骼異常但無法準確判斷胚胎晚期CCN1是否影響骨骼發(fā)育。CCN1和CCN2在活性和表達模式上有很多相似之處。盡管有相似之處，但在小鼠中分別敲除CCN1和CCN2后，卻表現(xiàn)出了完全不同的表型。CCN1主要導(dǎo)致心血管系統(tǒng)異常，CCN2則主要導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)畸形，以及嚴重的骨骼畸形。已經(jīng)成功構(gòu)建了敲除CCN3的小鼠，它們中也發(fā)現(xiàn)了CCN1和CCN2敲除小鼠中出現(xiàn)的缺陷，包括四肢和中軸骨缺陷、嚴重的關(guān)節(jié)畸形、心內(nèi)膜墊重塑形異常伴心臟隔缺損。CCN3突變小鼠的晶狀體中發(fā)現(xiàn)未成熟組織的退變，6個月以上的成年小鼠出現(xiàn)白內(nèi)障。到目前為止基因敲除的小鼠中尚未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)表型異常，因此CCN蛋白對神經(jīng)元細胞或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用至今未知。

2 CCN蛋白在組織修復(fù)及其他疾病中的作用

2.1 傷口愈合

CCN蛋白參與很多組織的修復(fù)。在損傷修復(fù)早期，從血小板的α顆粒中釋放出大量CCN2蛋白。CCN1和CCN2能直接與整合素αIIbβ3結(jié)合，支持血小板的粘附，并作為單核細胞等炎癥細胞的粘附底物。在損傷修復(fù)晚期即組織塑形過程，CCN蛋白也是高表達的。此時CCN蛋白協(xié)同TGF-β對基質(zhì)塑形，并可能與TNFα作用而觸發(fā)纖維母細胞的凋亡[11]。長骨骨折時，骨痂中CCN1和CCN2的表達增加，這在增殖的軟骨細胞和成骨細胞中尤其明顯?？贵w阻斷CCN1后能抑制小鼠骨折的愈合[12]，鼠關(guān)節(jié)炎模型中重組的CCN2蛋白能促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。這些研究提示CCN蛋白在骨和軟骨的修復(fù)中可能發(fā)揮重要作用。

2.2 CCN與纖維化疾病

CCN2過表達和各種器官的纖維化有緊密聯(lián)系。在皮下單獨注射TGF-β或CCN2只能短暫誘導(dǎo)肉芽組織生成，而聯(lián)合應(yīng)用TGF-β和CCN2則產(chǎn)生持續(xù)的纖維化反應(yīng)。推測認為TGF-β只是啟動纖維化反應(yīng)，CCN2則協(xié)同并增強TGF-β的作用。CCN2在肝臟纖維化和系統(tǒng)性硬化中有重要作用。用小干擾RNA敲除CCN2后可以阻止CCl4誘導(dǎo)的鼠肝臟纖維化[13]。肝硬化和纖維化的動物模型和病人中均發(fā)現(xiàn)纖維間隔中星狀細胞的CCN2表達升高。在體外，CCN2支持肝臟星狀細胞和橢圓形細胞的粘附，刺激星狀細胞增殖和橢圓形細胞的遷移[14]。此外，在系統(tǒng)性硬化或硬皮病中CCN2是顯著高表達的。人CCN2蛋白啟動子的多態(tài)性和硬皮病顯著相關(guān)[15]。這些研究結(jié)果強調(diào)了CCN2在纖維化中的重要作用，提示CCN2可能是抗纖維化的潛在治療靶點[16]。

2.3 糖尿病腎病

小鼠足細胞CCN2過表達會加重糖尿病腎病提示CCN2在此疾病中有重要作用[17]，而用反義寡核苷酸減少CCN2的表達能減輕腎臟纖維化及減輕糖尿病小鼠的腎病[18]。在體外，CCN2促進腎小球系膜細胞的存活，刺激基質(zhì)沉積，抑制高糖對基質(zhì)的退變作用。近來一些獨立研究顯示血漿或腎臟中的CCN2水平是糖尿病腎病的一個有用指標[19-20]。

2.4 血管疾病

CCN1和CCN2在動脈粥樣硬化灶的VSMC和球囊血管成形術(shù)后再狹窄病灶中過表達。用小干擾RNA或FOXO3a抑制CCN1表達可以減少球囊血管成形術(shù)后新生內(nèi)膜增生，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)再次增加CCN1表達可以逆轉(zhuǎn)此結(jié)果[21-22]。這些結(jié)果強調(diào)CCN1在血管修復(fù)方面的重要作用，提示抑制CCN1可能可以預(yù)防血管手術(shù)后的再狹窄[22]。

2.5 腫瘤

大量的研究工作支持以下觀察：（1）很多組織來源的腫瘤都有CCN的異常表達。（2）CCN基因的異常表達對腫瘤有促進或抑制作用，取決于腫瘤類型。（3）在有些腫瘤中，抗CCN治療可以抑制腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移。（4）CCN基因表達情況可以作為很多腫瘤的診斷或預(yù)后指標[22-24]。

CCN促進腫瘤生長的一個可能機制是促進腫瘤血管生成。CCN促進腫瘤生長的另外一個機制是增強腫瘤細胞的生存能力。矛盾的是，CCN蛋白也可以抑制腫瘤的生長。例如，CCN1抑制裸鼠中非小細胞肺癌的生長。CCN2通過CRMP-1依賴方式抑制肺腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，抑制結(jié)腸直腸的腫瘤的轉(zhuǎn)移。能調(diào)節(jié)IGF信號的CCN6能抑制炎性乳腺癌的生長[24]。

CCN蛋白的抗血管和凋亡活性方便可以促進或抑制腫瘤生長，CCN蛋白在腫瘤中的作用是復(fù)雜的，可能涉及多個下游效應(yīng)器。理解CCN蛋白如何促進或抑制腫瘤生長還需要進一步的研究。雖然如此，各種腫瘤中和CCN蛋白之間存在很強的相關(guān)性提示此蛋白是一個有價值的預(yù)后因子，CCN信號通路可能是一個新的抗腫瘤靶點。

3 結(jié)論和展望

目前認為CCN家族蛋白是一個和發(fā)育及損傷修復(fù)有關(guān)的ECM相關(guān)性多功能調(diào)節(jié)因子。在細胞水平，CCN蛋白直接與整合素結(jié)合發(fā)揮作用，有些情況下需HSPGs和LRPs起協(xié)同受體作用。CCN調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移、增殖、分化、凋亡、生存。此外，他們還與包括TGF-β、TNFα、VEGF、BMPs，及Wnt家族成員在內(nèi)的生長因子和細胞因子相互作用并調(diào)節(jié)它們的生物利用度和（或）活性，從而具有廣泛的作用。CCN蛋白是血管生成和軟骨發(fā)育的有力調(diào)節(jié)因子，在損傷修復(fù)、纖維疾病和腫瘤中也發(fā)揮重要作用。最近研究強調(diào)他們作為細胞粘附分子既能促進細胞死亡又能促進細胞存活，還能復(fù)雜地調(diào)節(jié)TNFα等炎癥細胞因子的細胞毒性作用。盡管已知在生理條件下CCN1可以調(diào)節(jié)TNFα，CCN蛋白在炎癥中的作用還沒有得到徹底的研究；盡管CCN蛋白的功能性結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被描繪出來了，而且一些特定整合素結(jié)合部位已經(jīng)被確定，但它的三維結(jié)構(gòu)仍然不清楚。CCN蛋白中半胱氨酸殘基含量異乎尋常地高，提示這可能是一個明顯影響其功能的結(jié)構(gòu)。

到目前為止基因打靶研究確定了CCN蛋白在心血管和骨骼發(fā)育中的關(guān)鍵作用。但是由于小鼠敲除CCN1或CCN2后在胚胎發(fā)育期或出生前后就死亡了，因而無法得知它們在發(fā)育晚期及疾病過程中的作用。因此，在特定組織或一定條件下消除CCN基因才能揭示它們在特定器官和組織中的作用。此外用突變的等位基因替換正常的CCN基因，從而消除CCN與特定受體或蛋白的結(jié)合能力的等位基因置換法可能可以說明CCN。

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