祖立闖,王金良,李 嬌,沈志強(qiáng),*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

核酸適體及其在疫病診斷中的應(yīng)用*

祖立闖1,王金良2,李 嬌1,沈志強(qiáng)1,2*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

核酸適體是采用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)中篩選出的能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的配體。因其具有親和力高、特異性強(qiáng)、精確識(shí)別、易體外合成與修飾等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為抗體的代替或補(bǔ)充試劑,已成功應(yīng)用于生物芯片、生物傳感器、分子信標(biāo)等多種疫病診斷技術(shù)平臺(tái),顯示出了良好的應(yīng)用前景,在未來(lái)的疫病診斷中將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。論文就適體技術(shù)及其在疫病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

核酸適體;指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);疫病診斷

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,人們意識(shí)到 DNA和RNA不僅是遺傳信息儲(chǔ)存和傳遞的載體,還可以借自身折疊形成特定的空間結(jié)構(gòu)與其他類(lèi)型的分子相互作用。指數(shù)擴(kuò)增富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是20世紀(jì)90年代初新出現(xiàn)的一種化學(xué)組合篩選技術(shù),由Tuerk C和Gold L在1990年首次提出[1],從而開(kāi)啟了一個(gè)研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的嶄新時(shí)代[2-3]。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸由兩端的固定序列和中間幾十個(gè)堿基的隨機(jī)序列組成文庫(kù),通過(guò)施加選擇壓力,并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù),經(jīng)過(guò)多輪的循環(huán)選擇富集,獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長(zhǎng)度一般為25個(gè)～60個(gè)核苷酸[4-5]。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱(chēng)為適配子(aptamer),國(guó)內(nèi)將其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識(shí)體和核酸適配體等。適體的出現(xiàn),使得篩選能識(shí)別各種靶物質(zhì)并能與靶物質(zhì)具有高親和性、高特異性結(jié)合的反應(yīng)物成為可能[6]。20多年來(lái),SELEX技術(shù)得到不斷的發(fā)展和成熟,篩選到的核酸適體不斷被應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究中[7-11]。適體在疫病診斷方面的應(yīng)用雖然起步較晚[12],但發(fā)展迅速,本文就適體技術(shù)及其在疫病診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景做一簡(jiǎn)要綜述。

1 核酸適體與靶蛋白作用的機(jī)理

SELEX首先根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù),人工合成單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù),文庫(kù)的兩端為固定序列,中間為長(zhǎng)度約25個(gè)～30個(gè)核苷酸隨機(jī)序列。寡核苷酸隨機(jī)區(qū)的每個(gè)核苷酸種類(lèi)都存在4種可能性(A、C、G、T),如果隨機(jī)區(qū)有n個(gè)核苷酸,那么隨機(jī)序列的多樣性有4n種。隨機(jī)區(qū)域長(zhǎng)度為30個(gè)核苷酸左右的文庫(kù)容量就能達(dá)到1014-15[13]。單鏈寡核苷酸易通過(guò)G-C、A-T配對(duì)(RNA中還存在G-U配對(duì))形成各種形狀的極其穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),如發(fā)卡(hairpin)、莖-環(huán)(stem-loop)、G-四聚體(G-tetramer)、假節(jié)(pseudoknot)、鼓包(bulge)等 ,這些結(jié)構(gòu)通過(guò)靜電作用、氫鍵作用、構(gòu)型互補(bǔ)等形式與靶物質(zhì)相互作用,或嵌合,或包被,形成穩(wěn)定的核酸-靶物質(zhì)復(fù)合物[3]。適體與配體間具有較大的接觸面積,能形成許多潛在的結(jié)合位點(diǎn),這一優(yōu)勢(shì)使適體甚至能識(shí)別配體間一個(gè)基團(tuán)的細(xì)微差別,因此其在理論上具有很高的特異性。適體識(shí)別蛋白質(zhì)靶序列的過(guò)程與抗體類(lèi)似,不同的是,抗體以初結(jié)構(gòu)去識(shí)別抗原決定簇,而適體則折疊成緊密的結(jié)構(gòu),嵌進(jìn)蛋白質(zhì)表面的裂縫中,這種作用機(jī)制就好比蛋白質(zhì)上形成“口袋”,適合該“口袋”的結(jié)構(gòu)嵌進(jìn),而其余的結(jié)構(gòu)終將被洗掉[14]。文庫(kù)中核苷酸隨機(jī)序列的多樣性決定了寡核苷酸立體構(gòu)象的多樣性,容量為1014-15的巨大文庫(kù)所蘊(yùn)含的豐富的核苷酸立體構(gòu)象幾乎模擬了自然界存在的所有可能與靶物質(zhì)相互作用所利用的空間結(jié)構(gòu),因此理論上應(yīng)用SELEX技術(shù)能篩選到自然界幾乎所有靶分子的適體。

2 核酸適體的篩選過(guò)程

2.1 建庫(kù)

SELEX篩選過(guò)程起始于化學(xué)合成的DNA或RNA隨機(jī)序列庫(kù),隨機(jī)序列兩端是帶有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的固定序列,此固定序列是多聚酶鏈反應(yīng)及其他酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點(diǎn)[4.13]。隨機(jī)序列不能太短,太短可能導(dǎo)致沒(méi)有足夠的二級(jí)結(jié)構(gòu)同靶分子結(jié)合;也不能太長(zhǎng),太長(zhǎng)可能由于全套文庫(kù)單鏈寡核苷酸序列一定,導(dǎo)致降低了選擇分離出來(lái)的配基概率。RNA隨機(jī)序列庫(kù)由DNA序列庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄而來(lái),如采用 RNA隨機(jī)序列庫(kù),預(yù)先應(yīng)將RNA多聚酶啟動(dòng)子序列(如T7 RNA多聚酶結(jié)合序列)引入5′端固定序列中以便體外逆轉(zhuǎn)錄合成DNA[15]。

2.2 文庫(kù)的篩選

在特定緩沖體系和選定的溫度下隨機(jī)序列與靶目標(biāo)混合溫育,此步中可以同靶物質(zhì)親和作用的特異性序列非常少,只有通過(guò)物理方法分離出結(jié)合序列。如靶目標(biāo)是大分子如蛋白質(zhì),通常用硝酸纖維素膜截留與靶蛋白質(zhì)分子結(jié)合的序列;或預(yù)先用生物素修飾靶蛋白質(zhì)分子,再用表面包被有鏈親和霉素的磁珠捕獲核酸-蛋白復(fù)合物。對(duì)于小分子靶目標(biāo)如核酸、多肽等,預(yù)先將其固定到固相支持物上制成親和基質(zhì),通過(guò)簡(jiǎn)單的洗脫即可以達(dá)到純化目的[16]。

2.3 文庫(kù)的擴(kuò)增

侯選序列的DNA片段和 RNA片段,可分別通過(guò)PCR或RT-PCR擴(kuò)增,生成次一級(jí)文庫(kù),再開(kāi)始下一輪篩選。隨著每一輪篩選嚴(yán)謹(jǐn)度的不斷增加,低親和力序列逐漸被淘汰。嚴(yán)謹(jǐn)度與溫度、pH、金屬離子、靶目標(biāo)濃度等有關(guān),在每一輪篩選中都應(yīng)進(jìn)行平行的親和力檢測(cè)實(shí)驗(yàn),最后一輪富集侯選庫(kù)中90%以上的序列都是能與靶分子特異結(jié)合的適體序列。約經(jīng)10輪～15輪篩選后,可獲得與靶物質(zhì)特異性高親和力結(jié)合的適體[17]。

2.4 文庫(kù)表征與效應(yīng)評(píng)價(jià)

最后一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序,并鑒定所篩選的核酸適配子與靶分子結(jié)合的特異性和親和力,也可通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得適配子與靶分子結(jié)合的最短序列[18]。

3 核酸適體在診斷學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)

抗體是目前進(jìn)行分子識(shí)別的主要物質(zhì),廣泛應(yīng)用于疾病的診斷。適體與靶物質(zhì)的結(jié)合類(lèi)似于抗原-抗體反應(yīng),其功能類(lèi)似于抗體,但具有抗體無(wú)法比擬的優(yōu)越性。

3.1 定量檢測(cè)

適體可以對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè),凡是涉及抗體的診斷方法,幾乎都可以用適體代替,與抗體可以對(duì)抗原進(jìn)行定量檢測(cè)一樣,適體也可以對(duì)靶蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)[5]。

3.2 作用的靶分子范圍廣

適體作用的靶分子遠(yuǎn)多于抗體,原則上自然界中所有物質(zhì)都可以通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出相應(yīng)的適體,包括金屬離子、有機(jī)分子、抗生素、核酸、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、病毒顆粒、大分子聚合物等。與抗體相比,適體作為檢測(cè)分子應(yīng)用范圍更廣,特別在抗原性弱的蛋白及非純樣品檢測(cè)中有明顯優(yōu)勢(shì)[2]。

3.3 特異性強(qiáng)

適體的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠分辨出靶分子結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差別,能識(shí)別靶物質(zhì)上一個(gè)甲基、羥基或一對(duì)映結(jié)構(gòu)體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。適體可能更適用于單克隆抗體難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或交叉抗原的鑒別診斷[12]。

3.4 親和力高

適體的獲得是根據(jù)每一適體與其相對(duì)應(yīng)靶物質(zhì)結(jié)構(gòu)的親和力不同而得到的,適體與靶分子間的結(jié)合具有比抗原抗體結(jié)合更高的親和力,它們作用的解離常數(shù)可達(dá)nmol甚至pmol水平,可以完全不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾[7]。

3.5 易修飾性

適體為寡聚核苷酸片段,可進(jìn)精確的位點(diǎn)修飾,且修飾后的適體保持原有的生物學(xué)活性。為了增加適體的功能,提高它在臨床診斷中的應(yīng)用,可以進(jìn)行廣泛的位點(diǎn)特異性修飾用以提供報(bào)告分子和效應(yīng)分子[19]。例如適體可以被熒光素、放射性同位素、生物素標(biāo)記,還可以與放射性核苷酸、細(xì)胞毒素相連。

3.6 穩(wěn)定性好

適體變性與復(fù)性可逆且速度快,變性的適體可在數(shù)分鐘內(nèi)再生,因而可反復(fù)使用,可長(zhǎng)期保存和在常溫下運(yùn)輸,這對(duì)診斷試劑都是極其有利的[13]。而抗體易發(fā)生不可逆變性,對(duì)溫度敏感需低溫運(yùn)輸。

3.7 制備容易,周期短

隨著 SELEX技術(shù)的不斷完善和自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn),適體的篩選周期越來(lái)越短,一個(gè)適體的篩選和制備只需2～3個(gè)月時(shí)間,而制備抗體至少需要3～6個(gè)月。篩選出的適體可通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增,有極佳的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,幾乎消除了制備的批間差異[5]。

3.8 與靶分子的結(jié)合條件可調(diào)控

適體是在體外篩選的,不需經(jīng)過(guò)體內(nèi)(動(dòng)物、細(xì)胞)體系,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定篩選條件來(lái)改變特性,從而實(shí)現(xiàn)適體與靶分子結(jié)合條件的調(diào)控。而抗體篩選是在動(dòng)物體內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞條件下進(jìn)行的,很難對(duì)抗體與靶分子的結(jié)合進(jìn)行調(diào)控[9]。

3.9 無(wú)免疫原性

篩選過(guò)程在體外而不在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行,靶物質(zhì)的免疫原性強(qiáng)弱不影響其適體的篩選,適體無(wú)免疫原性,體內(nèi)不產(chǎn)生免疫反應(yīng),可用于體內(nèi)診斷[20]。

3.10 分子較小、應(yīng)用靈活

適體(8×103～15×103)比抗體分子小,易于通透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的靶分子,可用于細(xì)胞內(nèi)診斷[19]。

4 核酸適體在疫病診斷中的應(yīng)用

核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性,使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景,盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道很少,但應(yīng)用適體檢測(cè)靶蛋白的研究卻不斷增多,基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。

Horii K等利用SELEX技術(shù)篩選到了針對(duì)神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿(sphingosylphosphorylc holine,SPC)且與分磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)無(wú)交叉反應(yīng)的特異性RNA適體,為研制基于RNA適體的SPC醫(yī)學(xué)診斷及闡述SPC的生物學(xué)功能提供了有價(jià)值的工具[21]。Yoon S篩選到了針對(duì)衣殼蛋白的2個(gè)RNA適配子,通過(guò)電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)和表面等離子體共振分析(SPR)表明RNA適配子具有較高的親和力和特異性,且可以中和PCV-2在PK-15細(xì)胞的感染,提出中和適體成為PCV-2檢測(cè)試劑和抗PCV-2有效治療藥物的候選者[22]。Joshi R等[23]篩選到了5株針對(duì)沙門(mén)菌的特異性DNA適體,為食品和環(huán)境樣品中沙門(mén)菌的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。Gopinath S C等[24]篩選到了針對(duì)B型流感病毒血球凝集素蛋白的適體,該適體與B型流感病毒血球凝集素蛋白無(wú)交叉反應(yīng),為流感病毒的分型診斷提供了基礎(chǔ)。在國(guó)內(nèi),李衛(wèi)濱等[25]運(yùn)用SELEX技術(shù)采用了生物素-鏈親和素磁珠分離法制備次級(jí)文庫(kù),從合成的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)中篩選到針對(duì)CsA的特異性適體,為小分子物質(zhì)適體的篩選提供一個(gè)技術(shù)平臺(tái),也為建立檢測(cè)全血CsA濃度的快速而簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)室診斷方法奠定基礎(chǔ)。王立峰等[26]通過(guò)體外7輪篩選獲得癌胚抗原(CEA)特異性適體,證實(shí)所獲得的CEA適體可特異性地與純化CEA和天然狀態(tài)的 CEA蛋白結(jié)合,為后續(xù)高表達(dá)的CEA腫瘤的靶向診斷和治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。詹林盛等[27]利用重組的HCV核心蛋白為靶蛋白,從隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)中篩選出了較強(qiáng)結(jié)合活性的HCV C蛋白特異寡核苷酸適體,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析,為HCV C蛋白抗原檢測(cè)和以C蛋白為靶位的抗HCV治療奠定基礎(chǔ)。馬占忠等[28]建立了以微孔板為篩選介質(zhì),生物素-鏈親和素-辣根過(guò)氧化物酶顯色系統(tǒng)測(cè)定親和力的方法,該設(shè)計(jì)基于較成熟的ELISA技術(shù)之上,操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化,具有較好的推廣價(jià)值,為MTB的臨床診斷提供了新的思路和方法。甘龍杰等[29]利用SELEX技術(shù),篩選能與金黃色葡萄球菌外毒素B(SEB)特異、高親和力結(jié)合的ssDNA適體(A11),并運(yùn)用該適體初步建立酶連接適體檢測(cè)方法,通過(guò)對(duì)臨床6例患者血清標(biāo)本的檢測(cè),得出獲得的ssDNA適體針對(duì)SEB的特異性強(qiáng),能識(shí)別SEB患者血清,提出酶連接適體的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏,具有很好的應(yīng)用前景。

“三明治夾心法”原用于抗體檢測(cè)技術(shù),基于抗體的診斷模式中以雙抗體夾心法最為常用,其中一個(gè)抗體為捕捉分子,另一抗體為檢測(cè)分子。核酸適體檢測(cè)靶物質(zhì)時(shí)也可借鑒這種模式。將一個(gè)適體的末端交聯(lián)到一個(gè)固相上作為“捕獲者”,去捕獲待測(cè)標(biāo)本中的靶物質(zhì),另一個(gè)適體的 5′端標(biāo)有相應(yīng)的指示劑,如:熒光素、生物素、放射性同位素等,這種適體稱(chēng)之為“報(bào)告者”。當(dāng)“報(bào)告者”與相應(yīng)的待測(cè)標(biāo)本結(jié)合后,就會(huì)有相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生。Austin M A等[30]將2個(gè)適體同時(shí)作為捕獲分子和檢測(cè)分子進(jìn)行雙位點(diǎn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。Ahn D G等[31]篩選到了針對(duì)SARS N蛋白的 RNA適體,可以特異性的結(jié)合N蛋白C羧基末端,以此適體為捕獲抗原試劑,建立了檢測(cè)SARS N蛋白的適體-抗體免疫測(cè)定法,可檢測(cè)SARS N蛋白最低濃度為2 pg/mL,提出建立的適體-抗體免疫測(cè)定法將成為SARS的敏感、特異的檢測(cè)方法。Yan X R等[32]利用篩選到的2株RNA適體,建立了檢測(cè)細(xì)胞因子的酶聯(lián)適體測(cè)定法(ELONA),通過(guò)與ELISA的對(duì)比后發(fā)現(xiàn),ELONA更加敏感、最低檢測(cè)下限為100 pg/mL,為細(xì)跑因子的檢測(cè)提供了極其敏感、特異的檢測(cè)方法。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)是借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞等單分散顆粒的高通量細(xì)胞生物學(xué)分析方法,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)時(shí)常用熒光標(biāo)記適體進(jìn)行染色,以獲得靶標(biāo)分子的信息,識(shí)別不同靶標(biāo)亞群。以往的流式細(xì)胞術(shù)是通過(guò)不同顏色的熒光素標(biāo)記單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)的,基于抗體流式細(xì)胞技術(shù)存在一定局限,抗體分子較大,不易進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,與Fc受體存在非特異性結(jié)合,核酸適體的應(yīng)用可在一定程度解決這些問(wèn)題,提高檢測(cè)的可靠性,促進(jìn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的推廣應(yīng)用。Davis K A等[33]首次報(bào)道了適體用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的研究,他們篩選到了與中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,HNE)高親合力結(jié)合適體能象抗HNE熒光標(biāo)記抗體一樣地有效檢測(cè)HNE包被的微珠。證實(shí)了適體代替抗體用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的可行性。

作為有效的生物識(shí)別片段,核酸適體在光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器及壓電生物傳感器等多種傳感器檢測(cè)平臺(tái)上得以應(yīng)用。Lee M等[34]將凝血酶特異性適體應(yīng)用于光纖生物傳感器,縮短了檢測(cè)時(shí)間,每次檢測(cè)不超過(guò)15 min。Liss M 等[35]將IgE適體應(yīng)用于石英蛋白生物傳感器,可對(duì)IgE定量檢測(cè),并通過(guò)傳感器對(duì)適體與IgE親和力進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)適體能夠耐受反復(fù)的親和洗脫等過(guò)程,且傳感器的靈敏度幾乎沒(méi)有降低[35]。

分子信標(biāo)(molecular beacon)是近年發(fā)展起來(lái)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的檢測(cè)技術(shù)。Li J J等[36]建立的適體分子信標(biāo)(moleculptamer beacon,MAB)技術(shù),用于凝血酶檢測(cè)。Fang X等[37]將針對(duì)血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)β鏈的適體兩端分別連接熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán),可以在體液或細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測(cè)到pmol/濃度的PDGF。Bruno J G等[38]篩選到了針對(duì)FMDV VP1的特異性適體,并建立了檢測(cè)口蹄疫病毒的定量的競(jìng)爭(zhēng)性熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法,可在10 min內(nèi)定量檢測(cè)到臟器內(nèi)25 ng/mL～250 ng/mL的口蹄疫病毒,為口蹄疫的快速診斷提供了一種極其敏感、特異的定量檢測(cè)方法。

5 小結(jié)與展望

抗體為臨床檢測(cè)和治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ),并且成為目前臨床檢驗(yàn)不可缺少的部分。隨著SELEX技術(shù)的出現(xiàn),提供了分離能識(shí)別各種各樣靶物質(zhì)并對(duì)相應(yīng)靶物質(zhì)具有高親和力和特異性寡核苷酸適體的可能性。這些稱(chēng)之為“適體”的寡核苷酸片段,開(kāi)始在治療與檢測(cè)方面與抗體競(jìng)爭(zhēng)。凡是涉及抗體的診斷領(lǐng)域,幾乎都可以用適體代替,特別是可以彌補(bǔ)抗體在診斷領(lǐng)域中應(yīng)用的不足。在雙位點(diǎn)結(jié)合試驗(yàn)?zāi)Ｊ街幸延醒芯勘砻?適體比單克隆抗體更適于難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或交叉免疫反應(yīng)的鑒別診斷;在分子信標(biāo)模式中,一般分子信標(biāo)只能用于核酸的檢測(cè),而新建立的適體分子信標(biāo)可以用于非核酸物質(zhì)如蛋白質(zhì)的檢測(cè)。此外,適體在毛細(xì)管電泳、流式細(xì)胞術(shù)、熒光偏振等分析模式中都發(fā)揮著非常重要的作用;在傳感器方面,與抗體介導(dǎo)的免疫傳感器相比,適體的特點(diǎn)是親和力高、特異性強(qiáng)、靶分子范圍廣、且穩(wěn)定性好、可快速變性復(fù)性、能反復(fù)使用、容易制備、便于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸。

但核酸適體作為診斷試劑仍處于發(fā)展階段,尤其應(yīng)用于體內(nèi)診斷仍有一些問(wèn)題需要解決,大規(guī)模應(yīng)用還需一段時(shí)間;盡管目前還沒(méi)有適體毒副作用的報(bào)道,但各種修飾適體安全性需要進(jìn)一步證明。有研究表明,經(jīng)體外篩選獲得的核酸適體在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)失效[39]?？傊?與比較成熟的抗體技術(shù)相比,適體技術(shù)還處在發(fā)展的初級(jí)階段,但它正以飛快的速度不斷完善自己。核酸適體作為檢測(cè)試劑的市場(chǎng),將隨著人們對(duì)它的不斷認(rèn)識(shí),開(kāi)發(fā)前景會(huì)越來(lái)越好。

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Nucleic Acid Aptamer and Its Application in Disease Diagnosis

ZU Li-chuang1,WANG Jin-liang2,LI Jiao1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Shandong Lvdu Bio-Sciences and Technology Co.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Nucleic acid aptamers are ligands with high specificity and affinity for their targets,which are screened from large oligonucleotide pools by the systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)technology.For their high specificity and affinity,accurate identification,easily synthesized and modifiedin vitro.Nucleic acid aptamers have become the substitutes or complement antibody reagents,and have been applied in the technology platforms for bio-chips,biosensors,molecular beacons detection,showing a good application,and will play an increasingly important role.In this paper,aptamer technology and its application in disease detection were reviewed.

nucleic acid aptamer;systematic evolution of ligands by exponential enrichment;disease diagnosis

S854.4

A

1007-5038(2011)07-0080-05

2010-11-14

祖立闖(1981-),男,黑龍江賓縣人,碩士,主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。*通訊作者