馮學(xué)忠,黎華鵬,盤苑芷,方炳虎,張魁華

(1.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興 527400;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉又稱復(fù)方地美硝唑可溶性粉,其主要成分為地美硝唑[1]、甲氧芐啶[2]、磺胺對(duì)甲氧嘧啶[3]。本品為廣譜抗菌和抗球蟲藥,對(duì)革蘭陰性菌(雞巴氏桿菌、大腸埃希菌、沙門菌等)、革蘭陽(yáng)性菌(化膿性鏈球菌、肺炎球菌等)、雞球蟲、組織滴蟲和豬痢短螺旋體等均有良好作用[4-6]。主要用于防治雞的巴氏桿菌病、大腸埃希菌病、球蟲病、傷寒及家禽的肺炎、腸炎等。復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉在《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版中是采用高效液相色譜法測(cè)定含量[7-8],其是采用甲醇-水不同比例的流動(dòng)相,不同的檢測(cè)波長(zhǎng)分別測(cè)定甲氧芐啶、地美硝唑與磺胺對(duì)甲氧嘧啶。本試驗(yàn)通過優(yōu)化色譜條件,建立了同時(shí)測(cè)定上述3種成分含量的高效液相色譜法,其具有簡(jiǎn)便可行、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn),減少了配制流動(dòng)相、稀釋樣品、進(jìn)樣次數(shù)等實(shí)驗(yàn)步驟,提高了工作效率,取得了滿意效果,可為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;CP225D型電子天平,德國(guó)賽多利斯有限公司;pHS-3C型精密pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 藥品 地美硝唑?qū)φ掌?批號(hào)為H 0390906,含量99.9%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;甲氧芐啶對(duì)照品,批號(hào)為 H 0160704,含量100.0%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品,批號(hào)為H 0300904,含量100.0%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉,規(guī)格為100g:地美硝唑8.0g+磺胺對(duì)甲氧嘧啶7.4g+甲氧芐啶2.0g,批號(hào)為20100501,20100502,20100503,廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司;磷酸為分析純;乙腈、甲醇為色譜純;水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶波長(zhǎng)的確定 精密稱取地美硝唑?qū)φ掌?、甲氧芐啶對(duì)照品、磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品適量,用500mL/L甲醇溶液分別制成每1 mL中含10、5、10μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以500mL/L甲醇溶液為空白,按照紫外分光光度法,在190 nm～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收?qǐng)D譜掃描,并確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 1 g/L磷酸溶液 取磷酸1.18mL,加水適量使成1 000 mL,搖勻,備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Discovery C18,尺寸:250 mm×4.60mm,5μm;流動(dòng)相:1 g/L磷酸溶液-乙腈(90:18);檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

1.2.4.1 地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱定地美硝唑?qū)φ掌?7m g,置50mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀釋至刻度,制成0.54 mg/mL溶液,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.4.2 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱定甲氧芐啶對(duì)照品27 mg,置200mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀釋至刻度,制成0.135 mg/mL溶液,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.4.3 磺胺對(duì)甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱定磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品25 mg,置50 mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀釋至刻度,制成0.5mg/mL溶液,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.5.1 地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取上述1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 1、2、3、4、5 mL,分別置于25 mL的容量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻;制成濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,照高效液相色譜法測(cè)定。

1.2.5.2 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取上述1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 1 、2 、3、4、5、6 mL,分別置于100 mL的容量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻 ;制成濃度分別為 5、10 、15、20、25 、30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,照高效液相色譜法測(cè)定。

1.2.5.3 磺胺對(duì)甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取上述 1.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 1、2、3、4 、5mL,分別置于25 mL的容量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻;制成濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,照高效液相色譜法測(cè)定。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉(批號(hào):20100501)約 338 mg,置50 mL容量瓶中,加500mL/L甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置50 mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度 ,搖勻,放置 0、0.5 、1.0、1.5、2.0、2.5 h,照高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 系統(tǒng)適應(yīng)性 精密稱定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉(批號(hào):20100501)約 338m g,按 1.2.6方法進(jìn)行稀釋并檢測(cè)。

1.2.8 空白試驗(yàn) 按處方比例稱取輔料適量,制備不含地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶的空白樣品,按1.2.6項(xiàng)下方法進(jìn)行稀釋并進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 回收試驗(yàn) 精密稱定地美硝唑?qū)φ掌?、甲氧芐啶對(duì)照品、磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品適量,按處方量加入其他輔料,制成其含量為標(biāo)示量的80%、100%、120%三種樣品,分別按1.2.6項(xiàng)下方法稀釋并測(cè)定其峰面積。

1.2.10 精密度試驗(yàn) 精密稱定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉(批號(hào):20100501)約338 mg,按1.2.6項(xiàng)下方法進(jìn)行溶解稀釋,搖勻,作為測(cè)定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉精密度試驗(yàn)用溶液,重復(fù)測(cè)定5次,進(jìn)行精密度試驗(yàn),照高效液相色譜方法進(jìn)行測(cè)定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

1.2.11 樣品含量測(cè)定 取批號(hào) 20100501,20100502,20100503的復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉,分別精密稱定約338 mg,按1.2.6項(xiàng)下方法溶解稀釋,搖勻,作為供試品溶液;另外精密吸取1.2.4項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5 mL置同一個(gè)50 mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液,按1.2.3項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,用外標(biāo)法計(jì)算樣品中地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)結(jié)果

在190 nm～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收?qǐng)D譜掃描顯示,在波長(zhǎng)230 nm處分別都有最大吸收或較大吸收分別見(圖1～圖3)。因此,選擇230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果見表1。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=25.58C+4.31(r=1,n=5,C的單位為 μg/mL)。結(jié)果表明,在 20μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖4)。

表1 地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積Table1 The peak-area of standard solution of dimetridazole

圖1 地美硝唑紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 The UV spectrum of dimetridazole

圖2 甲氧芐啶紫外吸收?qǐng)D譜 Fig.2 The UV spectrum of trimethoprim

圖3 磺胺對(duì)甲氧嘧啶紫外吸收?qǐng)D譜Fig.3 The UV spectrum of sulfamethoxydiazine

圖4 地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard cu rve of dimetridazole

2.2.2 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果見表2。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=99.37C-6.53(r=0.999 9,n=6,C的單位為μg/mL)。結(jié)果表明,在5μg/mL～30 μg/mL的濃度范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖5)。

表2 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積Table2 The peak-area of standard solution of trimethoprim

2.2.3 磺胺對(duì)甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果見表3。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=64.35C+6.35(r=1,n=5,C的單位為μg/mL)。結(jié)果表明,在20μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖6)。

表3 磺胺對(duì)甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積Table3 The peak-area of standard solu tion of su lfamethoxydiazine

圖5 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard cu rve of trimethoprim

圖6 磺胺對(duì)甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of su lfamethoxydiazine

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

從表4可見,復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉在2.5 h內(nèi)峰面積基本保持不變,穩(wěn)定性良好。

表4 復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table4 The stability result of compound dimetrdazolie solub le pow der

圖7 高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatogram

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果

連續(xù)進(jìn)樣6次,所得峰面積的RSD分別為地硝咪唑0.26%,甲氧芐啶 0.16%,磺胺對(duì)甲氧嘧啶0.02%。理論板數(shù)分別為按地美硝唑峰計(jì)算,理論板數(shù)為 17417;按甲氧芐啶峰計(jì)算,理論板數(shù)為15881;按磺胺對(duì)甲氧嘧啶峰計(jì)算,理論板數(shù)為20083。保留時(shí)間分別約為地美硝唑5.0 min,甲氧芐啶8.2 min,磺胺對(duì)甲氧嘧啶11.9min。地美硝唑峰、甲氧芐啶峰和磺胺對(duì)甲氧嘧啶峰的分離度符合要求(圖7)。

2.5 空白試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果在其3種成分的保留時(shí)間處均無吸收,不干擾測(cè)定,符合要求。

2.6 回收試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表5,根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別求出地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率,平均回收率分別為99.87%、99.83%和99.57%,RSD分別為0.73%、1.46%和0.85%。

結(jié)果表明,復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉回收率試驗(yàn)符合要求。

2.7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉中3種成分含量的RSD分別為(地美硝唑)0.22%、(甲氧芐啶)0.15%、(磺胺對(duì)甲氧芐啶)0.03%,結(jié)果見表6。結(jié)果表明,本法具有良好的精密度。

2.8 樣品含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見表7。結(jié)果表明,復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉的含量符合要求。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版中是選用液相色譜中最基礎(chǔ)溶劑組合甲醇-水作為流動(dòng)相,結(jié)果色譜峰拖尾嚴(yán)重,分離度及柱效較低。曾試用乙腈-水組合作為流動(dòng)相結(jié)果也是一樣。鑒于地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶等成分具有弱堿性,考慮在流動(dòng)相中使用偏酸性的緩沖液,這樣可以改善峰形,防止拖尾,分離效果較好。通過對(duì)緩沖液種類,濃度,有機(jī)溶劑,流動(dòng)相配比等影響分離效果的參數(shù)進(jìn)行多次選擇優(yōu)化,最終確定用0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)作為流動(dòng)相。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table5 Recovery test results

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table6 Precision of compound dimetrdazolie soluble powder

表7 樣品含量結(jié)果Table7 conten t of the sample results

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)對(duì)地美硝唑、甲氧芐啶和磺胺對(duì)甲氧嘧啶3種對(duì)照品溶液進(jìn)行了190 nm～500 nm紫外光譜掃描,結(jié)果表明,地美硝唑在316 nm、228 nm 和197 nm出有最大吸收,在230 nm處有較強(qiáng)吸收;甲氧芐啶在280 nm和204 nm處有最大吸收,在230 nm處也有較強(qiáng)吸收;磺胺對(duì)甲氧嘧啶在270、230、212、197 nm處有最大吸收?？紤]到在200 nm附近存在“邊緣效應(yīng)”,溶劑在此波長(zhǎng)下也有紫外吸收,會(huì)對(duì)檢測(cè)帶來較大影響;而且甲氧芐啶在樣品中含量較低,地美硝唑和磺胺對(duì)甲氧嘧啶在樣品中含量較高,為了提高甲氧芐啶檢測(cè)靈敏度,減少3個(gè)成分峰之間峰高的差別,所以選擇了230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 試驗(yàn)可行性

在所選定色譜條件下,對(duì)樣品中的地美硝唑、甲氧芐啶和磺胺對(duì)甲氧嘧啶等成分進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)各峰之間均無干擾,各峰的分離度均大于1.5,而且峰形較好,對(duì)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)亦證明了此法同時(shí)測(cè)定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉中三種主要成分是一種簡(jiǎn)便、有效、準(zhǔn)確的方法。在實(shí)際應(yīng)用過程中,針對(duì)某一種樣品,可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相配比來控制分析時(shí)間,提高分析效率。此外,操作過程簡(jiǎn)單,減少樣品在處理過程中的損失,定量更準(zhǔn)確,易于推廣。

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