蔣 偉,黎滿香,林榮高,田世成

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

腸球菌定居于人類和動物的口腔、陰道,是腸道的正常菌群成員之一,且廣泛分布于自然界,通常不引起發(fā)病,是一種重要的機會致病菌[1]。醫(yī)學(xué)臨床上由于抗生素的濫用,多重耐藥菌株的出現(xiàn),使腸球菌的感染率不斷上升,成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌,通常引起傷口感染、尿道感染、腹腔感染、血流感染等,尤其見于免疫力低下或患有危重基礎(chǔ)疾病患者。在獸醫(yī)臨床中,腸球菌引起的畜禽感染也日趨增多[2],給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。

1 腸球菌的分類及生理學(xué)特性

1.1 腸球菌的分類

腸球菌屬于過氧化氫酶陰性、無芽胞、兼性厭氧的革蘭陽性球菌。無法用表型將腸球菌與其他的革蘭陽性、過氧化氫酶陰性的球菌相區(qū)分,只能通過排除法區(qū)分。腸球菌最初被分類為腸內(nèi)的革蘭陽性球菌,之后歸入鏈球菌屬。根據(jù)其DNA雜交和16 S rRNA序列分析,1984年將腸球菌從鏈球菌屬中分離出來,建立了腸球菌屬。1994年《Bergey′s鑒定細菌學(xué)手冊》(第九版)正式將腸球菌屬列為一個獨立的菌屬。到1999年,腸球菌屬正式命名的菌種有19個,分別是鳥腸球菌(E.avium),驢腸球菌(E.asini),病臭腸球菌(E.malodoratus),假鳥腸球菌(E.pseudoavium),棉子糖腸球菌(E.raffinosus),解糖腸球菌(E.saccharolyticus),糞腸球菌(E.faecalis),屎腸球菌(E.faecium),黃色腸球菌(E.flavescens),鉛黃腸球菌(E.casseliflavus),鶉雞腸球菌(E.gallinarum),蒙氏腸球菌(E.mundtii),堅忍腸球菌(E.durans),殊異腸球菌(E.dispar),小腸腸球菌(E.hirae),盲腸腸球菌(E.cecorum),硫磺腸球菌(E.sulfureus),鴿腸球菌(E.columbae)和孤立四聯(lián)球菌(E.solitarius),至2003年腸球菌屬已增加到31個種[3]。

1.2 腸球菌生理學(xué)特性

有氧情況下,腸球菌在5℃～50℃范圍內(nèi)皆可生長。糞腸球菌和屎腸球菌能在60℃生存30 min。部分菌株具有溶血性,含50 mL/L的鮮血TSA瓊脂板可檢測其溶血性,如用兔血或綿羊血,但各種血液對該菌溶血的敏感性差異較大。糞腸球菌和屎腸球菌能在pH 4.6～9.9的范圍生長,最適pH為7.5,也能在400 g/L膽汁鹽中生長[4]。糞腸球菌能在含65 g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長,還具有陽離子平衡功能,能耐酸、堿、高鹽及干燥。

2 腸球菌的致病性

2.1 腸球菌對人的致病性

腸球菌感染包括尿道感染、肝膽管的敗血癥、心內(nèi)膜炎、外科手術(shù)感染、菌血癥和新生兒的敗血癥等。我國醫(yī)院高致病性區(qū)(ICU)感染中腸球菌屬在革蘭陽性菌中居第3位,位于葡萄球菌、鏈球菌之后。北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科對2005年10月至2008年8月間從該院臨床標(biāo)本中分離出的184株腸球菌進行鑒定,結(jié)果184株腸球菌中糞腸球菌133株(72.3%),屎腸球菌32株(17.4%),其他種類腸球菌19株(10.3%)[5]顯示腸球菌感染率明顯上升。

2.2 腸球菌對動物的致病性

腸球菌也是動物消化道、生殖道常在菌,在獸醫(yī)臨床中對其導(dǎo)致疾病的研究還不夠系統(tǒng)。但不斷有其對畜禽危害的報道,如可引起公豬睪丸炎、鶉雞敗血癥、雞胚死亡及產(chǎn)弱雛,引起駝鳥肺部及胸腔化膿、家兔腹瀉、羔羊腦炎等[6]。楊躍飛等[7]從鷓鴣眶下竇內(nèi)分離到1株糞腸球菌,證實腸球菌可引起鷓鴣眼炎。王亞賓等[8]從引起河南省三門峽某豬場肥育仔豬發(fā)病死亡的病豬中分離出2株糞腸球菌,證實了糞腸球菌可導(dǎo)致仔豬關(guān)節(jié)炎及發(fā)病死亡。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室也已用糞腸球菌感染小鼠,期望能從小鼠的病理變化中找出腸球菌導(dǎo)致動物疾病的機制。

3 毒力因子

腸球菌的毒力強弱依次為從臨床上分離的、從食物中分離的和從定居地分離的菌株[9]。許多感染被認為是內(nèi)源性的,細菌通過小腸上皮細胞易位,然后通過淋巴結(jié)引起感染,再擴散到身體的其他細胞。因此決定腸球菌毒力的因素很多,如是否能夠黏附在細胞外基質(zhì)蛋白,包括凝血酶敏感素、乳鐵蛋白及玻璃體結(jié)合蛋白等;是否能夠黏附在尿道上皮細胞、口腔上皮細胞和人胚胎腎細胞。而這些因素皆由菌株攜帶的毒力因子調(diào)控。

3.1 聚集物質(zhì)

聚集物(aggregation substance,AS)是信息素誘導(dǎo)的表面糖蛋白,是細菌質(zhì)粒得以進行接合傳遞的蛋白,能黏附真核細胞。另一方面腸球菌表面的聚集物質(zhì)能形成較大的聚集物,因此給細菌提供了病原性。聚集物的存在增加了細菌表面的疏水性,誘導(dǎo)膽固醇定位在吞噬小體內(nèi),延遲或阻擋了溶酶體的融合作用。Tendolkar P M等[10]在研究腸球菌引起的心臟感染的小鼠模型時,發(fā)現(xiàn)給小鼠注射含有聚集物質(zhì)AS及結(jié)合物質(zhì)EBS(enterococcal binding substance,AS受體)的菌株AS+EBS+株,小鼠出現(xiàn)癥狀并死亡,給予AS—EBS—株則均存活,進一步在用導(dǎo)管插入術(shù)構(gòu)造心內(nèi)膜炎的小鼠模型中發(fā)現(xiàn),AS+EBS+菌株產(chǎn)生的贅生物較大,脾腫大更嚴重,認為AS在心內(nèi)膜炎中起重要作用。

3.2 膠原結(jié)合蛋白

膠原結(jié)合蛋白(accessory colonization factor,Ace)是另一種糞腸球菌的表面蛋白,它屬于微生物表面成分識別黏附基質(zhì)分子家族,介導(dǎo)腸球菌黏附于宿主細胞外基質(zhì)蛋白,引起感染發(fā)生,是腸球菌的主要毒力因子之一[11]。膠原結(jié)合蛋白在心內(nèi)膜炎中起著重要作用。

3.3 表面蛋白

表面蛋白(enterococcus surface protein,esp)基因在感染來源的分離株中出現(xiàn)頻率高,它編碼的蛋白可以促進細菌吸附、定殖在宿主細菌上和逃逸宿主免疫系統(tǒng)的清除作用。esp參與腸球菌生物膜的形成,而腸球菌的生物膜能幫助細菌抵抗不良的環(huán)境,幫助吸附在真核細胞如尿道上皮細胞上,因此在抵抗抗生素中起重要作用。研究表明,esp基因的破裂損害了糞腸球菌形成生物膜的能力,esp—糞腸球菌株在獲得含esp基因的質(zhì)粒后,又能產(chǎn)生細胞膜[12]。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室從死亡豬體內(nèi)分離的42株菌中esp基因的檢出率為38%,在正常豬體內(nèi)分離菌株未檢出該基因,提示該基因可能與致病性有密切關(guān)系,這與Mannu L[28]結(jié)果一致。esp+屎腸球菌比esp—屎腸球菌具有更高的結(jié)合率,而且對氨比西林、環(huán)丙沙星和亞胺培南具有更高的抵抗性[13]。

3.4 溶血素

腸球菌溶血素(cytolysin,cyl)是一種細菌毒素,其基因位于信息素應(yīng)答的質(zhì)粒里。溶血素對人血有β-溶血的作用,對其他革蘭陽性細菌有抑制作用。溶血素基因以高發(fā)生率出現(xiàn)在臨床分離株(33%,與食物分離株6%對比)[14]。

3.5 透明質(zhì)酸酶

透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase,hyl)能分解機體組織的透明質(zhì)酸,是一種降解與組織破壞有關(guān)的酶。透明質(zhì)酸酶能解聚結(jié)締組織的粘多糖,促進細菌和毒素在組織內(nèi)擴散[15]。透明質(zhì)酸酶由細菌基因組上的hyl基因編碼的。

3.6 明膠酶和絲氨酸蛋白酶

明膠酶(gelatinase,gelE)是一種由糞腸球菌分泌的細胞外鋅離子金屬蛋白內(nèi)肽酶。能水解明膠、酪蛋白、血紅蛋白和生物活性肽,引起細菌擴散,參與炎癥的進程。吳利先等[16]構(gòu)建糞腸球菌絲氨酸蛋白酶(serine protease,sprE)基因的突變株,突變株在40℃的生長能力以及在氧化條件下的存活率均明顯降低,說明sprE基因在細菌抵抗外界溫度環(huán)境中具有一定的作用。

3.7 心內(nèi)膜炎抗原

心內(nèi)膜炎抗原(endocarditis antigen,efaA)是腸球菌的表面蛋白黏附素,可以分泌到血清中與細胞壁結(jié)合,糞腸球菌通過EfaA的黏附作用,通過EfaA定植于心內(nèi)膜、形成生物膜、導(dǎo)致感染性心內(nèi)膜炎[17]。efaA是腸球菌的重要毒力因子之一。

3.8 信息素

信息素(pheromone)是糞腸球菌分泌的一個小的線形肽段(7～8個氨基酸),可誘導(dǎo)腸球菌的asa1等基因,表達聚集物質(zhì),促進菌株之間質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移,及黏附宿主細胞。同時信息素還具有人白細胞趨化劑的作用,誘導(dǎo)其分泌溶酶體酶,激活補體系統(tǒng),引起炎癥部位的組織損傷[18]。

3.9 莢膜多糖

莢膜多糖(capsular polysaccharides,cps)在許多微生物中是主要的毒力因子,主要幫助微生物逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測和清除。Hancock L E等[19]構(gòu)建了無莢膜多糖的糞腸球菌的突變體,結(jié)果表明,突變體在體外增強了對巨噬細胞殺滅的敏感性,在體內(nèi)聚集在淋巴結(jié)的周圍,表現(xiàn)為抵抗力下降。

4 腸球菌的耐藥性

自1986年首次從環(huán)境中分離到耐萬古霉素糞腸球菌V583以來,對于腸球菌耐藥性的監(jiān)測及其耐藥機制的研究受到廣泛關(guān)注。目前對腸球菌耐藥性監(jiān)測顯示,其耐藥性日益增強,而且在近幾年來不斷的報道有對新的藥物耐藥,甚至是還未投入使用的藥物產(chǎn)生耐藥性。所以對于腸球菌耐藥機制及其防治對策的研究已愈顯重要。近年來的研究結(jié)果顯示,腸球菌耐藥機制可以分為兩類,一類是由于腸球菌的細胞壁較厚,導(dǎo)致其固有的由染色體介導(dǎo)的耐藥性。另外一種是由于腸球菌通過轉(zhuǎn)座子、整合子-基因盒系統(tǒng)等途徑獲得外源DNA片段,從而獲得多種耐藥性。

4.1 腸球菌固有耐藥性

腸球菌的固有耐藥性主要是針對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。據(jù)報道,腸球菌對于青霉素的敏感性較低,尤其是糞腸球菌對其敏感性比一般細菌低10倍～100倍,而屎腸球菌對比糞腸球菌又低約15倍。導(dǎo)致這種差異主要是由于腸球菌能合成一種低青霉素結(jié)合蛋白(PBPs),使細菌與青霉素的結(jié)合率降低,從而達到使之耐藥的目的。研究顯示,腸球菌對該類藥物的耐藥性與β-內(nèi)酰胺酶的合成量成正比,并有細菌滴度依賴性,即細菌濃度在107cfu/mL以上,才顯示對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥,這一結(jié)論也在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室近期研究中得到證實,這可能亦是臨床上很少分離到對青霉素及氨芐西林高度耐藥菌株的原因。另外腸球菌還可以產(chǎn)生過量慢反應(yīng)青霉素結(jié)合蛋白(PRS),使青霉素與氨基糖苷類藥物聯(lián)合用藥也不能起到治療作用。

4.2 腸球菌獲得性耐藥性

腸球菌屬細菌除了本身具有的耐藥性而外,還可以從環(huán)境中獲得耐藥性。一是通過接合型轉(zhuǎn)座子獲得外源基因,從而獲得耐藥性。接合型轉(zhuǎn)座子綜合了質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子等可移動性元件的特性,能使耐藥基因乃至毒力基因在細菌及環(huán)境中廣泛傳播。自1986年首個轉(zhuǎn)座子Tn916型被發(fā)現(xiàn)以來,Tn1514、Tn1546、T n916、Tn1545相繼被證實與腸球菌耐藥性有關(guān);二是通過整合子-基因盒系統(tǒng)[20]來獲得耐藥性。整合子-基因盒系統(tǒng)是在腸球菌中存在的一類天然的基因克隆系統(tǒng),其具有自己的翻譯起始位點,具有比較突出的基因捕獲能力和表達能力,能從環(huán)境中捕獲多種耐藥性基因并整合到整合子上并通過自身的表達系統(tǒng)進行表達,而且其基因盒中可以同時整合多個基因,使單個菌株具有多重耐藥性。另外腸球菌還可以通過自我修飾從而達到耐藥的目的。以耐萬古霉素糞腸球菌為例,即是通過調(diào)節(jié)其基因的表達,使其與糖肽類抗生素的結(jié)合位點末端的D-丙氨酸-D-丙氨酸殘基改變?yōu)镈-丙氨酸-D-乳酸,使藥物不能與其靶標(biāo)結(jié)合,從而達到耐藥的目的。

近年來,研究人員試圖從腸球菌屬的進化過程中的一些遺傳標(biāo)記來尋找其耐藥機制,已取得明顯的成效,如Kelli L等[21]利用成群的、周期性的空間短回文序列重復(fù)(clustered,regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)將歷史分離菌株利用多重序列位點分分型(multiple locus secequence typing,MLST)進行基因分型,然后檢測其基因組中CRISPR,分析得出CRISPR-Cas的存在與菌株耐藥性存在顯著性關(guān)系。

5 腸球菌的實驗室檢測技術(shù)

5.1 細菌學(xué)檢測方法

腸球菌在臨床診斷中很容易和鏈球菌相混淆,因為腸球菌和鏈球菌屬于同一個科中的不同屬,所以實驗室常采用鏈球菌選擇培養(yǎng)基進行腸球菌的初選,臨床上經(jīng)常用鏈球菌增菌培養(yǎng)基來初選腸球菌。然后是將吡咯烷酮芳胺酶(PYR)試驗與氯化鈉-膽汁七葉苷試驗結(jié)合應(yīng)用,即將待檢菌新鮮培養(yǎng)物大量接種置35℃培養(yǎng)4 h觀察結(jié)果,以培養(yǎng)基變褐色或黑色為陽性[22]。但是腸球菌的生化試驗結(jié)果差異較大,僅以形態(tài)、培養(yǎng)和生化反應(yīng)等表型特征難以將細菌準(zhǔn)確歸類。張聯(lián)璧[23]報道在腸球菌鑒定中,首先表現(xiàn)為革蘭陽性球菌、觸酶陰性、成對或成鏈排列的菌株可先用萬古霉素、PYR等試驗區(qū)別不同的菌屬,符合腸球菌屬者,再按不同試驗對不同群的不同種進行鑒定。對于種間的鑒定,可參照Carvalho Mds G等[24]提出的鑒定方案進行。

微生物鑒定的自動化技術(shù)在近十幾年里得到了飛速的發(fā)展,使得腸球菌的鑒定也變得更加的迅速和準(zhǔn)確。薛青紅等[25]利用BIOLOG自動微生物分析系統(tǒng)和傳統(tǒng)鑒定方法同時對1株豬源糞腸球菌進行了鑒定,結(jié)果顯示,2種鑒定方法的結(jié)果一致,與傳統(tǒng)的鑒定方法對比。

5.2 分子生物學(xué)檢測

由于常規(guī)的病原學(xué)診斷方法包括樣本中的細菌分離培養(yǎng)及藥敏試驗,所需時間較長,已經(jīng)難以及時指導(dǎo)感染性疾病的治療。但隨著細菌分子生物學(xué)與基因組學(xué)的飛速發(fā)展,快速、靈敏的核酸檢測方法己用于細菌的檢測,并且廣泛被人們所接受。目前分子生物學(xué)檢測技術(shù)在腸球菌種、屬水平都有較多的報道。

Wellinghausen N等[26]應(yīng)用熒光原位雜交的方法快速診斷與臨床密切相關(guān)的腸球菌,如糞腸球菌、屎腸球菌和鶉雞腸球菌,結(jié)果表明該方法具有很強的敏感性和特異性。為了從屬的水平對腸球菌做出鑒定,Liu D等[27]用糞腸球菌種的特異假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因作為靶序列,設(shè)計PCR引物擴增518 bp的DNA片段,這個片段只出現(xiàn)在糞腸球菌中,而不出現(xiàn)在其他的腸球菌中,可用來作為糞腸球菌的特異性診斷方法。Halliday E等[28]以腸球菌特異的23 S rDNA序列為靶序列,用定量PCR檢測腸球菌在海灘上的分布。Jackson C R等[29]設(shè)計屬和23個種的腸球菌特異性引物,使用7組多重PCR能夠同時將腸球菌屬及種鑒定出來,這些屬和種的多重PCR使得腸球菌的診斷更為快速。

在腸球菌種的分子生物學(xué)鑒定方面還有許多其他有效的方法。建立多種快速、結(jié)果易于判讀的鑒定細菌的分子生物學(xué)診斷方法是對常規(guī)檢查方法的一種有益的補充。相信隨著現(xiàn)代化生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,將會出現(xiàn)更多更好鑒定細菌的方法,使腸球菌的鑒定更加完善。

5.3 血清學(xué)鑒定方法

腸球菌亞群屬于革蘭分群的D群,所以血清學(xué)的檢測方法有鏈球菌乳膠凝集分型法。除此之外,用得最多的就是ELISA方法,如Hufnagel M等[30]用莢膜多糖特異性ELISA分析了4個國家不同地方臨床感染病例中分離的157株糞腸球菌的血清型,分析結(jié)果表明,優(yōu)勢血清型的地理區(qū)域特征不明顯。周霞等[31]利用糞腸球菌的超聲波裂解物包被ELISA反應(yīng)板,通過棋盤滴定方法篩選最佳反應(yīng)條件,成功地建立了檢測致羔羊腦炎糞腸球菌抗體的間接ELISA方法,利用該方法檢測了來自未免疫綿羊場的50份成年綿羊的血清和50份羔羊的血清,結(jié)果表明,2份成年綿羊的血清為陽性,其他樣品均為陰性。

6 展望

人們一直認為腸球菌是人類正常的微生物菌群、是無害的、在醫(yī)學(xué)上也是不重要的。直到腸球菌成為醫(yī)院里最普通的病原,引起較高的死亡率,腸球菌在不利環(huán)境下的生存能力較強,能多途徑引起交叉污染,包括通過食物、環(huán)境及醫(yī)院途徑引起人類的疾病,才開始對腸球菌重新認識。由于多重耐藥性腸球菌的暴發(fā),近年來對于腸球菌的關(guān)注已日益增加,而且近年來的相關(guān)研究已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)倪M展,但對于逐年上升的感染率和日益增多的耐藥株的出現(xiàn),對腸球菌在致病過程中的作用機制研究及尋求新的治療方法已迫在眉睫。而對于目前腸球菌的分類鑒定,特別是與D群的鏈球菌相區(qū)分,需要進一步的研究來提高效率和準(zhǔn)確性?？傊?進一步地探明腸球菌的生物學(xué)特性、致病機制、耐藥性、實驗室診斷以及治療方法等是控制腸球菌感染的重要的理論基礎(chǔ)。

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