葛鑫宇 陳寶田 林曉春 于 林 杜念念 (南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 5055)

由于抑郁障礙具有高發(fā)病、高復(fù)發(fā)、高致殘的特點(diǎn)，不僅給患者及家屬生活質(zhì)量帶來影響，而且給社會(huì)及家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的三環(huán)類抗抑郁劑(TCA)和單胺氧化酶抑制劑(MAOⅠ)不良反應(yīng)較大，且起效緩慢。新型抗抑郁藥物5-HT再攝取抑制劑(SSRⅠ)副作用小，如舍曲林、帕羅西汀等，但仍有胃腸道及神經(jīng)功能等不良反應(yīng)〔1〕。本研究以柴胡桂枝湯加味和舍曲林對(duì)照觀察大鼠抑郁模型行為學(xué)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雌性Wistar大鼠48只，鼠齡6～8 w，體重(200±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(scxk粵2006-0015)。按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、柴胡桂枝湯加味高、中、低劑量組、舍曲林組，每組8只。造模方法采用慢性中等強(qiáng)度應(yīng)激刺激模型(CMU)〔2，3〕，包括以下幾種不同的應(yīng)激因子:光照(24 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、擁擠(24 h)、孤養(yǎng)(24 h)、游泳(5 min)。每種刺激隨機(jī)進(jìn)行，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生。造模時(shí)間為給藥7 d后連續(xù)3 w。給藥柴胡桂枝湯加味低、中、高劑量組分別給予濃度為29、58、116 g/ml柴胡桂枝湯加味藥液;西藥組給予舍曲林濃度為2.6 mg/ml混懸液。

1.2 藥物 柴胡桂枝湯加味組成:柴胡24 g、黃芩10 g、黨參10 g、半夏 10 g、生姜 10 g、大棗 10 g、甘草 10 g、桂枝 10 g、白芍20 g、生龍骨 30 g、生牡蠣 30 g、棗仁 15 g、遠(yuǎn)志 10 g、合歡皮20 g、夜交藤70 g。水煎兩次，濾汁棄渣，合并藥液，共煎出400 ml藥液，含生藥量290 g。將藥液分別濃縮至濃度為29、58、116 g/ml冷藏備用。舍曲林(大連輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10980141)用之前以雙蒸水配制成2.6 mg/ml混懸液。

1.3 曠場(chǎng)試驗(yàn)(Open-field test)〔4〕觀察 將大鼠單獨(dú)置于高40 cm，底面邊長(zhǎng)為100 cm的方柱體內(nèi)。底面用黑線平均劃分為面積相等的25塊方格。以動(dòng)物穿越方格塊數(shù)為水平活動(dòng)等分，以站立次數(shù)為垂直得分。每只大鼠在給藥第28天進(jìn)行一次測(cè)定，每次5 min。

1.4 樣品制備及測(cè)定 采用雙抗體夾心ABC-ELⅠSA法，用抗大鼠NGF、BDNF單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的大鼠NGF、BDNF與單抗結(jié)合，加入生物素化抗大鼠NGF、BDNF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，492 nm處測(cè)OD值，大鼠NGF、BDNF濃度與OD值呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中大鼠NGF、BDNF的含量。BDNF試劑盒購(gòu)自于南京斯倍恩科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)試驗(yàn)得分 見表1。與正常組比較，模型組及各治療組水平得分明顯降低(P＜0.05，P＜0.001)，而各治療組較模型組有所改善(P＜0.001)。與正常組比較，模型組垂直得分降低(P＜0.001)，其他治療組較模型組有所改善(P＜0.001)。

2.2 海馬內(nèi)NGF與BDNF 見表2。與正常組比較，模型組NGF、BDNF水平明顯降低(P＜0.001)，與模型組比較，西藥組及柴胡中、高劑量組NGF和BDNF含量明顯升高(P＜0.001，P ＜0.05)。與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.001;與模型組比較:3)P＜0.001

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分(n=8，±s)

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分(n=8，±s)

組別 水平得分 垂直得分柴胡桂枝湯加味低劑量組 51.88±10.8822) 11.88±3.2712)柴胡桂枝湯加味中劑量組 74.88±1.0512)3) 14.63±3.2921)柴胡桂枝湯加味高劑量組 98.38±14.5891)3) 18.75±2.9153)西藥組 96.75±15.6551)3) 19.00±2.6193)模型組 45.63±12.8942) 11.13±3.9442)正常組116.38±27.563 19.25±5.874

表2 各組大鼠海馬NGF和BDNF水平(n=8，±s，ng/ml)

表2 各組大鼠海馬NGF和BDNF水平(n=8，±s，ng/ml)

與正常組比較:1)P＜0.001;與模型組比較:2)P＜0.001，3)P＜0.05

組別NGF BDNF柴胡桂枝湯加味低劑量組 259.00±24.5991) 17.58±4.3731)柴胡桂枝湯加味中劑量組 304.37±36.9443) 25.37±6.7021)3)柴胡桂枝湯加味高劑量組 310.25±53.3073) 37.97±5.2302)西藥組 318.00±31.0483) 35.46±4.8032)模型組 221.12±47.6011) 18.32±6.1421)正常組337.87±52.015 40.38±7.951

3 討論

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁癥”范疇。古代醫(yī)家有關(guān)郁癥的論述分為兩類，一是指一切人體氣血津液等瘀滯不通而生的疾病，即氣血津液之郁;二是專指情志抑悒憂郁的疾病，即情志之郁。而與抑郁癥關(guān)系最密切的應(yīng)為情志之郁。情志疾病的概念最早源于《內(nèi)經(jīng)》，認(rèn)為人的精神意識(shí)、思維活動(dòng)，以喜、怒、憂、思、悲、恐、驚七種情志變化為其表現(xiàn)形式。外有所觸，則情有所變，內(nèi)有所動(dòng)。《內(nèi)經(jīng)》把情志因素看作導(dǎo)致人體致病的重要因素。認(rèn)為七情五志的太過不及，特別是憂愁不解，直接影響臟腑功能的運(yùn)轉(zhuǎn)和氣血津液的輸化，甚則氣機(jī)郁滯，產(chǎn)生病癥。本試驗(yàn)選用小柴胡湯疏肝結(jié)郁，調(diào)節(jié)情志;桂枝白芍調(diào)和陰陽(yáng);佐以棗仁補(bǔ)肝、寧心安神，遠(yuǎn)志安神益智，合歡皮、夜交藤養(yǎng)心安神〔5，6〕。故臨床上取得良好療效。

本研究采用中等強(qiáng)度慢性應(yīng)激方法建立大鼠抑郁模型，經(jīng)行為學(xué)評(píng)分測(cè)定，證實(shí)該模型基本模擬了抑郁癥患者的快感缺乏，興趣缺失，精神運(yùn)動(dòng)遲滯等抑郁表現(xiàn)。柴胡桂枝湯加味高劑量組在曠場(chǎng)試驗(yàn)中水平得分和垂直得分較模型組有明顯改善，且與舍曲林組無顯著差異，證明該方有良好的抗抑郁作用。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起到關(guān)鍵作用〔7〕。臨床和臨床前實(shí)驗(yàn)研究表明海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變涉及抑郁癥的病理生理學(xué)過程，功能性影像學(xué)研究提示抑郁癥患者前額葉皮質(zhì)、腹側(cè)紋狀體和海馬的體積減少〔8〕。尸檢表明抑郁癥患者在前額葉皮質(zhì)存在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元數(shù)目的顯著減少，在海馬亞區(qū)存在突觸前標(biāo)志物GABA能中間神經(jīng)元的減少〔9〕。以上研究表明抑郁癥患者與海馬神經(jīng)元細(xì)胞的丟失和海馬體積的減少相關(guān)聯(lián)。

NGF是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)、也是生物學(xué)功能了解得最清楚的一個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。NGF對(duì)皮質(zhì)、海馬、基底前腦的膽堿能神經(jīng)元有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用〔10〕。在成年大鼠腦內(nèi)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白含量最高的部位是海馬，其次是皮質(zhì)和嗅球;而NGF則廣泛存在于全腦，在海馬、新皮質(zhì)和嗅球內(nèi)NGF表達(dá)量最高〔11〕。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族中的主要成員之一。研究資料表明BDNF與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生存以及多巴胺能、膽堿脂能、5-羥色胺能神經(jīng)元的可塑性密切相關(guān)〔12〕。BDNF還可能通過對(duì)D3受體基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)神經(jīng)元的增殖、分化和生存發(fā)揮作用，在神經(jīng)精神疾病中起作用〔13〕。國(guó)內(nèi)外的研究表明，即慢性應(yīng)激的抑郁癥模型鼠的大腦(尤其是海馬)BDNF表達(dá)下調(diào)，經(jīng)抗抑郁藥處理能使BDNF表達(dá)水平上升。說明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與神經(jīng)元的可塑性和存活性，可能涉及抑郁癥的治療機(jī)制之一。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平下降參與了抑郁癥的某些病理生理過程，可能是抑郁癥的基本病理改變之一。本研究表明提示柴胡桂枝湯加味改善大鼠海馬內(nèi)BDNF水平是治療抑郁癥的機(jī)制之一。

1 賈建平.神經(jīng)科特色診療技術(shù)〔M〕.上海:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007:638.

2 Yan HC，Cao X，Das M，et al.Behavioral animal models of depression〔J〕.Neurosci Bull，2010;26(4):327-37.

3 Wu H H，Wang S.Strain differences in the chronic mild stress animal model of depression〔J〕.Behav Brain Res，2010;213(1):94-102.

4 Padilla E，Shumake J，Barrett DW，et al.Novelty-evoked activity in open field predicts susceptibility to helpless behavior〔J〕.Physiol Behav，2010;101(5):746-54.

5 吳海波，熊嘉瑋，陳寶田.安神方對(duì)失眠大鼠中樞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響〔J〕.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009;9(6):628-30.

6 趙智勇，耿慧春，姚 兵，等.柴胡桂枝湯抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕. 中醫(yī)藥信息，2006;23(3):50-1.

7 Perry D，Hendler T，Shamay-Tsoory SG.Projecting memories:the role of the hippocampus in emotional mentalizing〔J〕.Neuroimage，2011;54(2):1669-76.

8 Niehusmann P，Seifert G，Clark K，et al.Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus〔J〕.J Neurosci，2010;30(18):6225-35.

9 Munoz A，Mendez P，Defelipe J，et al.Cation-chloride cotransporters and GABA-ergic innervation in the human epileptic hippocampus〔J〕.Epilepsia，2007;48(4):663-73.

10 Liu X，Wang D，Liu Y，et al.Neuronal-driven angiogenesis:role of NGF in retinal neovascularization in an oxygen-induced retinopathy model〔J〕. Ⅰnvest Ophthalmol Vis Sci，2010;51(7):3749-57.

11 Herrera DG，Maysinger D，Gadient R，et al.Spreading depression induces c-fos-like immunoreactivity and NGF mRNA in the rat cerebral cortex〔J〕.Brain Res，1993;602(1):99-103.

12 Klein AB，Trajkovska V，Erritzoe D，et al.Cerebral 5-HT(2A)receptor and serotonin transporter binding in humans are not affected by the val66met BDNF polymorphism status or blood BDNF levels〔J〕.JCereb Blood Flow Metab，2010;30(11):e1-7.

13 Sokoloff P，Leriche L.Drugs acting on D3 receptors in neuropsychiatric disorders:facts and prospects.Ⅰmplication for schizophrenia and its treatment in the regulation of BDNF-dependence on D3 receptor expression〔J〕.Encephale，2007;33(Pt 3):870-2.