馬鳳巧 (南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)部生理教研室，河南 南陽(yáng) 473000)

目前阿爾茨海默病(AD)的防治已成為全球較為熱門的研究課題。黃精屬傳統(tǒng)中藥，有補(bǔ)中益氣，除風(fēng)祛濕，安五臟延年等作用，近年來(lái)有較多文獻(xiàn)報(bào)道黃精具有提高記憶力的藥理作用〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖致 AD大鼠模型，研究黃精對(duì) AD大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達(dá)的影響，探討黃精提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SD清潔大鼠40只(由河南醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，2～3月齡，體重(200±20)g，所有大鼠同室分籠標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 分組 在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下適應(yīng)1 w后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、黃精低、高劑量組，每組10只。但實(shí)驗(yàn)后各組動(dòng)物均有缺失。

1.2.2 藥品與試劑 黃精購(gòu)于河南省南陽(yáng)市醫(yī)藥公司;D-半乳糖購(gòu)于上海試劑二廠，批號(hào)20050422;一抗:Caspase-3兔抗鼠抗體，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.3 給藥方法 模型組、黃精低、高劑量組用3%D-半乳糖生理鹽水溶液按150 mg·kg-1·d-1頸后部皮下注射，對(duì)照組皮下注射等量的生理鹽水;同時(shí)黃精高、低劑量治療組分別按10、5 g/kg的黃精水煎劑灌胃，模型組和對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.3 檢測(cè)方法 6 w后進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力，實(shí)驗(yàn)后將大鼠斷頭處死，在低溫冰盤上取出海馬組織，通過(guò)免疫組化(二步法)檢測(cè)海馬組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)。采用DMR+Q550型病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每組次選取8個(gè)視野，采用統(tǒng)一的照相倍數(shù)采樣，對(duì)其染色強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 黃精對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期(EL)、撤離平臺(tái)后120 s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)象限內(nèi)游泳距離占整個(gè)游泳距離百分比及空間探索次數(shù)，模型組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，黃精高劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明高劑量黃精能提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，明顯改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見(jiàn)表1。

2.2 黃精對(duì)AD大鼠海馬組織內(nèi)Caspase-3表達(dá)的影響Caspase-3多數(shù)在胞漿表達(dá)，染色定位于胞漿，也可見(jiàn)于胞膜，陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)呈黃色到棕褐色，沒(méi)有Caspase-3表達(dá)的細(xì)胞為陰性，被染為淡黃色者為弱陽(yáng)性，被染為棕褐色者為強(qiáng)陽(yáng)性。免疫組化檢測(cè)，光鏡下蘇木素復(fù)染后，對(duì)照組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，胞漿和突觸不著色，未見(jiàn)Caspase-3蛋白表達(dá)，呈陰性。模型組大鼠海馬神經(jīng)元中可見(jiàn)大量的棕黃色Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物，胞漿被染色為棕色，呈強(qiáng)陽(yáng)性。用黃精煎劑灌胃進(jìn)行干預(yù)后，低劑量治療組大鼠海馬神經(jīng)元中Caspase-3的表達(dá)與模型組相比有所減少，被染為黃色，呈陽(yáng)性。黃精高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元中Caspase-3蛋白表達(dá)極少，染色很淺，僅見(jiàn)個(gè)別為弱陽(yáng)性。提示黃精對(duì)AD大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達(dá)有抑制作用，Caspase-3蛋白的表達(dá)隨黃精劑量的增大而減少。見(jiàn)圖1。

表1 黃精對(duì)AD大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響(±s)

表1 黃精對(duì)AD大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響(±s)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別 n EL(s) 所占距離的百分比(%) 探索次數(shù)(次/s)對(duì)照組 8 25.689 6±3.385 71) 34.865 0±6.624 51) 8.500 0±1.772 81)模型組 9 50.711 5±7.047 9 19.973 3±5.111 4 5.000 0±1.500 0黃精低劑量組 8 46.197 2±9.462 2 22.853 8±3.043 3 5.375 0±2.199 8黃精高劑量組 8 29.448 7±5.142 51) 34.208 8±4.671 31) 7.250 0±1.982 11)

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3表達(dá)(DAB，×400)

3 討論

研究表明，引起細(xì)胞凋亡的各種因素均應(yīng)先激活半胱氨酰天門冬酸特異性蛋白酶(Caspase)才能誘發(fā)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明Caspase家族在執(zhí)行和控制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用〔3〕，Caspase-3作為該級(jí)聯(lián)反應(yīng)中共同的下游凋亡執(zhí)行因子，執(zhí)行死亡程序，因此 Caspase-3被稱為死亡蛋白酶〔4〕。Caspase-3可通過(guò)兩條途徑激活，一條是線粒體通道，生理或病理性刺激，使線粒體膜的通透性增高，釋放細(xì)胞色素 C，Caspase-9激活并切割Caspase-3，使之轉(zhuǎn)化為具有酶催化作用的活性形式;另一條為死亡受體通道，通過(guò)細(xì)胞表面的死亡受體(TNFaR1、FAS)，激活 Caspase-8，進(jìn)而激活 Caspase-3〔5〕。近年來(lái)大量的研究表明，腦神經(jīng)元對(duì)凋亡損傷極其敏感，這為AD進(jìn)行早期干預(yù)、最大限度保護(hù)腦功能，從而減少海馬神經(jīng)元凋亡和丟失，以預(yù)防AD的發(fā)生提供了可靠的理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明Caspase-3與衰老大鼠海馬組織神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。黃精進(jìn)行干預(yù)后大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)較模型組有所減少，且隨劑量的增加，Caspase-3蛋白的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)。黃精治療AD的機(jī)制可能是通過(guò)某種途徑抑制Caspase-3的表達(dá)，減少海馬神經(jīng)元的凋亡。黃精作為一種對(duì)AD的治療手段，為AD防治開(kāi)辟了新的途徑，將會(huì)在臨床治療AD預(yù)防AD方面發(fā)揮重要作用。

1 李 銑，郭月英，孫隆儒，等.黃精改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙等作用的研究〔J〕.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001;18(4):286-9.

2 石 林，蒙義文，李 偉.黃精及黃精多糖的藥理研究〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1999;11(3):67-71.

3 Saikumay P，Dong Z，Mikhailov V，et al.Apoptosis:definition，mechanisms，and relevance to disease〔J〕.Am JMed，1999;107(5):489-506.

4 李小明，宋天保.“殺手”蛋白酶Caspase〔J〕.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2000;22(2):58-63.

5 Budihardjo Ⅰ，Oliver H，Lutter M，et al.Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis〔J〕.Annu Rev Cell Dev Biol，1999;15:269-90.