夏軼男 劉 敩 蔡 郁 于廣池 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 3004)

化療增敏劑通過逆轉(zhuǎn)腫瘤組織耐藥，干擾腫瘤細(xì)胞與組織微環(huán)境間耐藥信號傳導(dǎo)等提高化療效果。近年來，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用辛可寧、瑞米酚、酚塞嗪等藥物作為化療增敏劑，聯(lián)合化療藥物應(yīng)用，提高臨床治療效果〔1，2〕。本研究觀察鹽酸氯丙嗪聯(lián)合欖香烯制劑對人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率、細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡率的影響，為喉癌化療增敏劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 Hep-2細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，欖香烯乳注射液(大連金港制藥有限公司生產(chǎn));噻唑藍(lán)(MTT)試劑，RPMⅠ1640培養(yǎng)基(Sigma公司);胎牛血清(長春生物制品研究所)。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 單純欖香烯組取對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μl，靜止培養(yǎng) 12 h后每孔內(nèi)分別加入25、50、100 μg/ml欖香烯制劑，每個(gè)濃度10復(fù)孔，靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h，每孔內(nèi)分別加入MTT試劑20μl/孔，終濃度為50 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清，加入二甲基亞砜150μl/孔，振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算不同濃度欖香烯制劑對Hep-2細(xì)胞增殖抑制率的影響。

Hep-2細(xì)胞抑制率=(1-加藥孔細(xì)胞A值÷對照孔細(xì)胞A值)×100%

1.2.2 聯(lián)合組 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取欖香烯50μg/ml加入鹽酸氯丙嗪4 mg/ml，實(shí)驗(yàn)條件同1.2.1。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集經(jīng)不同條件作用后的Hep-2細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，離心棄上清，細(xì)胞經(jīng)70%冷乙醇固定，4℃保存，上機(jī)前過40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，碘化丙啶(PⅠ)染色，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，細(xì)胞增殖抑制率組間比較采用t檢驗(yàn)，細(xì)胞周期組間比較采用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Hep-2細(xì)胞增殖抑制率 MTT結(jié)果顯示單純欖香烯組(25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml)Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率分別為14.0%、23.9%和28.6%，與對照組相比差異顯著;而聯(lián)合組，即50μg/ml欖香烯與4 mg/ml氯丙嗪組對Hep-2細(xì)胞增殖抑制率為39.2%，抑制效果優(yōu)于100μl/ml欖香烯組，具有良好的增敏作用。

2.2 Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示單純欖香烯組隨著欖香烯濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，而G2/M期細(xì)胞相對增多，細(xì)胞凋亡率升高;而聯(lián)合組即50μg/ml欖香烯與4 mg/ml氯丙嗪組效果更為明顯。見表1，表 2。

表1 不同濃度欖香烯制劑對Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響(±s，%/24 h)

表1 不同濃度欖香烯制劑對Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響(±s，%/24 h)

與0μg/ml組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)0 μg/ml組29.4±2.1 61.2±4.7 8.7±1.5 0.3 25μg/ml組 45.8±4.41)38.1±4.12)16.1±2.91) 7.62)50μg/ml組 53.3±3.62)27.8±4.72)18.8±3.22) 12.62)100μg/ml組 62.2±5.12)15.9±2.22)21.5±3.62) 17.32)

表2 單純欖香烯組與聯(lián)合組對Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡率的影響(±s，%/24 h)

表2 單純欖香烯組與聯(lián)合組對Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡率的影響(±s，%/24 h)

與欖香烯組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)欖香烯組53.3±3.6 27.8±4.7 18.8±3.2 12.6聯(lián)合組 68.6±5.41) 9.5±2.12) 21.5±2.61) 17.32)

3 討論

化療增敏劑是指沒有抗腫瘤作用，但能提高已知有抗腫瘤作用藥物的化療效果，增強(qiáng)抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷或降低其對正常組織細(xì)胞毒性的一類藥物〔3〕。本研究應(yīng)用MTT比色法觀察欖香烯聯(lián)合氯丙嗪對Hep-2細(xì)胞的增殖抑制作用。欖香烯是國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥，動物實(shí)驗(yàn)及臨床證明對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用〔4〕;且毒副作用小，抗腫瘤譜廣，價(jià)格低廉，具有廣闊應(yīng)用前景。氯丙嗪屬于酚噻嗪類化合物，是鈣調(diào)蛋白抑制劑，與化療藥物合用后顯著改變化療藥物的藥代動力學(xué)機(jī)制〔5〕。MTT結(jié)果顯示，不同濃度的欖香烯制劑對Hep-2細(xì)胞增殖抑制率均有影響，與對照組相比差異顯著，尤其在50μg/ml欖香烯組增加4 mg/ml鹽酸氯丙嗪后，極大提高了對Hep-2細(xì)胞的增殖抑制效果，抑制率由23.9%升高至39.2%。因?yàn)镸TT試劑可被哺乳動物活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成藍(lán)色的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。所以，該方法被廣泛用于抗腫瘤藥物的篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究的客觀指標(biāo)。

本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的欖香烯對Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，結(jié)果表明，欖香烯能夠抑制Hep-2細(xì)胞G1期向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而使G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，造成G2/M期細(xì)胞相對增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)，這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上得到體現(xiàn)。G1期細(xì)胞是指細(xì)胞從有絲分裂到DNA復(fù)制之前，G1期是制造和產(chǎn)生mRNA、rRNA、tRNA及核蛋白體的階段，而且G1期也是藥物作用的敏感點(diǎn)〔6〕。因此，抑制G1期的RNA合成，可間接地使腫瘤細(xì)胞合成減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，欖香烯聯(lián)合氯丙嗪能顯著抑制G1期向S期轉(zhuǎn)化，造成G1期細(xì)胞堆積，不能進(jìn)入S期，從而使細(xì)胞增殖變緩，達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的。

1 王 濤，徐 軍，鐘南山.肺癌多藥耐藥生物逆轉(zhuǎn)策略〔J〕.國外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊，2002;29(5):378-80.

2 Sehn LZ，Hua YB，Yu XM，et al.Tamoxifen can reverse multidrug resistance of colorectal carcinoma in vivo〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(7):1060-4.

3 張志紅，宋朝暉.腫瘤化療增敏劑研究進(jìn)展〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2006;33(7):506-8.

4 周洪語，侯菊生，王 勇，等.欖香烯誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的劑量和時(shí)間依賴性研究〔J〕.中華腫瘤雜志，2006;28(4):270-1.

5 Okumieff P，Meyn RE，Teicher B，et al.Report from the radiation oncology committee of the southwest oncology group(SWOG):Research objectives workshop，2003〔J〕.Am JClin Oncol，2003;26(5):522-5.

6 Shao J，Lee SB，Guo H，et al.Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin〔J〕.Cancer Res，2003;63(17):5218-23.