趙丹玉 王 哲 馬賢德 趙金茹 王守巖 王德山 (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

眼針療法是我校著名老中醫(yī)彭靜山教授根據(jù)中醫(yī)理論經(jīng)絡(luò)學(xué)說，結(jié)合長期實(shí)踐而創(chuàng)立的一種微針療法〔1〕。30余年的臨床實(shí)踐證明本療法對于腦缺血再灌注損傷(CⅠRⅠ)的防治具有顯著療效，但機(jī)制尚不明確。近年來大量的研究表明，CⅠRⅠ病理生理變化過程中炎癥反應(yīng)是中心環(huán)節(jié)之一。本研究擬從與炎癥相關(guān)的Toll樣受體(TLR)4角度探討眼針的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料 健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，體重280～320 g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可號:SCXK(滬)2008-0016。RNAiso Reagent和RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司;免疫組織化學(xué)(SABC法)試劑盒和一抗TLR4多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型復(fù)制 60只大鼠以隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、假手術(shù)組、CⅠRⅠ模型組和眼針組，剔除造模不成功以及死亡鼠，最終每組均為12只。

正常組:常規(guī)喂養(yǎng)無任何施加因素。模型復(fù)制與成模標(biāo)準(zhǔn):采用改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血(MACO)再灌注動物模型〔2〕(右側(cè)栓塞)。造模后參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)〔3〕進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。神經(jīng)功能缺損評分≥1分為造模成功。將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組和眼針組。假手術(shù)組:術(shù)式與操作基本過程同模型組和眼針組，只是不進(jìn)行MACO。模型組常規(guī)喂養(yǎng)，不給予任何刺激。眼針組在缺血再灌注即刻、造模術(shù)后12 h及24 h(即處死前)各針刺1次。

1.2.2 眼針取穴與刺法 取穴參照人體取穴定位法分別取上焦區(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)〔3〕;刺法:用35 mm ×25 mm 毫針在相應(yīng)眼穴區(qū)距眶內(nèi)緣2 mm處平刺，由該區(qū)始點(diǎn)向該區(qū)終點(diǎn)方向刺入0.3 cm，行捻轉(zhuǎn)手法，留針30 min，每隔15 min行針1次，時間1 min。

1.2.3 免疫組化檢測TLR4蛋白表達(dá) 于造模術(shù)后24 h每組各取6只鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，先后用生理鹽水及4%多聚甲醛心內(nèi)灌流，迅速斷頭取腦，取額極至中腦間腦組織冠狀面置于4%多聚甲醛中后固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，每隔100μm連續(xù)作5μm厚腦冠狀面石蠟切片。石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟按即用型免疫組織化學(xué)試劑盒(SABC法)說明書操作。最后于高倍物鏡下觀察、照相及圖像處理分析，測定平均光密度值(MOD)。每張切片測定6個視野取平均值作為測定值。

1.2.4 RT-PCR檢測TLR4 mRNA表達(dá) 造模術(shù)后24 h每組各取6只鼠，10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，分離右側(cè)皮層組織?？俁NA提取用RNAiso Reagent試劑，按說明操作。提取后的總RNA分別于260 nm、280 nm紫外線下測定樣品吸光度，以鑒定純度。隨后用RTPCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR。TLR4的引物序列為:正義CCTGTGAGGTCGTTGAGGTTAG，反 義 GCATTGTATCGCCTTCTTAGCA，長度:290 bp，退火溫度:65℃;β-actin的引物序 列 為:正 義 GCACCAAGTGCCACAAAGGAA，反 義TGCGAAGCTGTAAAGGTGCCT，長度:592 bp，退火溫度:65℃。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分分析 (ⅠOD)，以TLR4的RTPCR產(chǎn)物ⅠOD與內(nèi)參β-actin的RT-PCR產(chǎn)物的ⅠOD比值表示TLR4 mRNA的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，進(jìn)行多組數(shù)據(jù)的方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 眼針對CⅠRⅠ模型大鼠一般狀態(tài)的影響 假手術(shù)組大鼠手術(shù)完成動物蘇醒后無神經(jīng)功能缺損體征出現(xiàn)，根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，均為0分。模型組及眼針組大鼠術(shù)中死亡7只，另外還有5只大鼠神經(jīng)功能缺損不明顯，最終造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和眼針組各12只。造模成功的大鼠蘇醒后出現(xiàn)明顯的不能完全伸展對側(cè)前爪、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及向?qū)?cè)傾倒等神經(jīng)功能缺損癥狀。術(shù)后24 h，模型組動物神經(jīng)功能缺損癥狀隨時間延長逐漸加重，神經(jīng)功能缺損評分具有明顯的上升趨勢;眼針組神經(jīng)功能缺損癥狀加重不明顯，顯示出眼針治療的腦保護(hù)作用。

2.2 眼針對CⅠRⅠ模型大鼠大腦皮層組織TLR4蛋白表達(dá)的影響 正常組及假手術(shù)組大鼠大腦皮層內(nèi)未見TLR4陽性細(xì)胞表達(dá)。CⅠRⅠ模型組可見較多的TLR4陽性細(xì)胞，胞質(zhì)著色，與正常組和假手術(shù)組比較有顯著性差異(P＜0.01);眼針組陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1，表1。

2.3 眼針對CⅠRⅠ模型大鼠大腦皮層組織TLR4基因表達(dá)的影響 正常組及假手術(shù)組TLR4 mRNA表達(dá)均較少，二者之間沒有顯著差異(P＞0.05);與正常組及假手術(shù)組比較，CⅠRⅠ模型組TLR4 mRNA呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(P＜0.01);而眼針組表達(dá)較模型組明顯下降(P＜0.05)。見圖2，表1。

圖1 眼針對CIRI模型大鼠右側(cè)大腦皮層組織TLR4蛋白表達(dá)的影響(IHC，DAB染色，×400)

表1 眼針對大鼠右側(cè)皮層TLR4表達(dá)的影響(±s，n=6)

表1 眼針對大鼠右側(cè)皮層TLR4表達(dá)的影響(±s，n=6)

與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

正常組0.2 3 4±0.0 0 2 0.6 3 3±0.0 5 5假手術(shù)組 0.2 3 5±0.0 0 3 0.6 7 7±0.0 2 5模型組 0.2 5 0±0.0 0 5 1) 1.2 9 3±0.3 2 2 1)眼針組 0.2 4 5±0.0 0 4 2) 1.0 9 3±0.1 2 0 2)

圖2 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3 討論

眼針療法是將眼睛周圍按照八卦分為八區(qū)十三穴，對應(yīng)人體相應(yīng)的五臟六腑、器官組織等。臨床上根據(jù)不同臟腑、器官的病變和病位選取相應(yīng)的穴位進(jìn)行針刺，從而達(dá)到治療全身不同部位疾病的目的。多年的臨床實(shí)踐證明，本療法對于急性腦出血性疾病具有很好的療效，然而眼針治療腦出血性疾病的作用機(jī)制亟待研究。

CⅠRⅠ損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及多個環(huán)節(jié)和多方面的因素。其中炎癥反應(yīng)在CⅠRⅠ中起到至關(guān)重要的作用。近年來對于與炎癥相關(guān)的多種疾病的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以導(dǎo)致腫瘤壞死因子(TNF)α、白細(xì)胞介素(ⅠL)-1等炎癥因子表達(dá)增高，加重組織的炎癥反應(yīng)。那么這個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是否也是CⅠRⅠ的機(jī)制之一，眼針療法是否可以對此起到抑制作用，這也是本研究要解決的問題。

已有大量的研究表明，TLR4與CⅠRⅠ損傷密切相關(guān)。Toll樣受體(TLR)家族成員在大腦的各組織細(xì)胞中均有表達(dá)，被認(rèn)為是目前哺乳動物唯一將細(xì)胞外抗原識別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白〔4〕。目前研究得最為清楚的是TLR4。TLR4是膜結(jié)合蛋白，當(dāng)與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)的5'端翻譯啟始區(qū)(TⅠR)結(jié)構(gòu)域能連接胞內(nèi)銜接蛋白MyD88，進(jìn)而啟動下游ⅠL-1受體相關(guān)激酶(ⅠRAK)磷酸化，繼而激活TNF受體相關(guān)因子(TRAF)〔5～8〕，激活 NF-κB，促進(jìn)多種細(xì)胞因子及炎癥因子的表達(dá)，啟動炎癥反應(yīng)〔9，10〕，即為 MyD88依賴的 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因敲除小鼠模型比正常小鼠模型的大腦CⅠRⅠ發(fā)生率更小，梗死面積更少〔11〕。研究報(bào)道，當(dāng) CⅠRⅠ時，TLR4 表達(dá)顯著升高〔12〕。因此，有學(xué)者提出，通過人為減少TLR4信號的激活，從而減少不利因素的產(chǎn)生，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病得以盡快恢復(fù)，可以作為治療中樞神經(jīng)疾病的良好方案〔13〕。

本研究通過RT-PCR和免疫組化檢測CⅠRⅠ模型組大鼠TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，與以往的研究基本一致，提示CⅠRⅠ時由于某些內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的釋放促進(jìn)了TLR4的表達(dá)，極有可能激活了TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而使NF-κB活化，啟動TNFα、ⅠL-1等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，加重了 CⅠRⅠ時炎癥反應(yīng)。而眼針組大鼠缺血側(cè)大腦皮層TLR4基因及蛋白表達(dá)均顯著降低，說明眼針刺激能夠抑制TLR4的表達(dá)，通過對膜受體蛋白表達(dá)的抑制作用而抑制其下游蛋白的活化，進(jìn)而抑制NF-κB與炎癥因子結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)控序列結(jié)合，抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕其炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到對腦皮層組織的保護(hù)目的，這可能是眼針對于CⅠRⅠ有顯著療效的機(jī)制之一。

1 彭靜山.眼針療法〔M〕.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1990:15-52.

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