肖 暉,王 珣,宋 洋,王秀君,張俐俐,盧泳全,李柱剛

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所 黑龍江省作物與家畜分子育種重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030）

生物質(zhì)能源是指來自于生物材料中的可再生能源,可用于加熱、發(fā)電、燃料以及生產(chǎn)副產(chǎn)物。生物質(zhì)能源的三大產(chǎn)物為乙醇、生物柴油、生物燃料。乙醇與生物柴油可作為燃料以及重要的化工原材料。因此,乙醇在以石油為基礎的經(jīng)濟向以生物質(zhì)能源為基礎的可持續(xù)經(jīng)濟和環(huán)境友好經(jīng)濟的轉(zhuǎn)變中起著至關重要的作用。目前,全球?qū)τ谝簯B(tài)燃料的需求日益增加,從植物中分離獲得乙醇和生物柴油也隨之備受關注。

隨著植物細胞壁中纖維素與半纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇這項技術(shù)的日趨經(jīng)濟化,從生物質(zhì)能源作物中提取可更新能源作為液態(tài)燃料的潛力也逐漸被發(fā)掘[1-2]。2002年開始,生物質(zhì)能源作物的殘余物成為研究重點。美國Component of Conservation Reserve Program（CRP）機構(gòu)研究表明[3-4],在2000-2004年,種植同樣面積的柳枝稷（Panicum virgatum）與玉米（Zea mays）,柳枝稷產(chǎn)量要高于玉米秸稈收獲量。通過直觀比較,多年生牧草能源作物能夠在貧瘠邊緣土地上產(chǎn)出等同于糧食作物秸稈所產(chǎn)出的相同含量的酒精。本研究從生物學特性、能源開發(fā)特性、栽培管理措施以及生物技術(shù)方法等方面綜述了生物質(zhì)能源作物柳枝稷的國內(nèi)外研究進展,為柳枝稷的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 柳枝稷的生物學特征

柳枝稷為直立多年生草本C4植物,其根系發(fā)達,株高可達4.0 m,葉片綠色扁平,長約150 cm,寬約1.3 cm[5]。6-8月開花,花序呈圓錐狀,15～55 cm長,分枝末端有小穗[6]。種子呈淺褐色,光滑且具有光澤,新收獲的種子具有較強的休眠性,品種間千粒重變化較大[5-7]。冬季地上部枯死,地下宿生根系依然存活,次年5月返青。

柳枝稷起源于北美,在對多種能源作物材料的篩選中,柳枝稷因其高產(chǎn)、多年生、具有水土保持能力以及對于貧瘠土地的強適應性等特點而被選為主要的牧草作物。柳枝稷可分為低地型和高地型兩種生態(tài)型[6],低地型主要分布于美國南部地區(qū),喜潮濕溫暖環(huán)境,適于種植于低緯度地區(qū),多為四倍體（2n=8×=72）；高地型主要分布于美國中部及北部地區(qū),喜干燥環(huán)境,適于種植在中高緯度地區(qū),且大多為八倍體[8]。不同的柳枝稷品種只有種植在與其起源位置相近地區(qū)才能表現(xiàn)出較高產(chǎn)量和生態(tài)適應性。

2 柳枝稷的能源開發(fā)特性

多年生能源牧草因其具有高木質(zhì)纖維素含量而成為生物能源產(chǎn)品的主要原料。與一年生作物相比,不需每年播種,可生長在貧瘠土地上,具有極強的抗寒能力[9-11]。同時,還可以減少土壤腐化、強化碳元素隔離,給野生生物提供習生地等[10,12-15]。

能源網(wǎng)平衡系統(tǒng)（net energy balance,NEB）在生物能源平臺上是一個重要的評價指標,只有具有高效NEB的作物才可以被認為具有生態(tài)可持續(xù)性和環(huán)境可持續(xù)性。這對于評價作物以及轉(zhuǎn)化過程是否有實質(zhì)性的生物技術(shù)投資價值是至關重要的。盡管目前在經(jīng)濟學角度上,以玉米淀粉為原料生產(chǎn)出的乙醇以及生物柴油能夠替代部分石油,但與以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)的乙醇相比,前兩者NEB均低于后者,且具有負面效應（表1）[16-18]。

表1 生物質(zhì)能源作物在不同平臺上的比較

如果具有高效NEB的木質(zhì)纖維素原料能夠被有效地轉(zhuǎn)化為乙醇,那么其產(chǎn)量最高可能達到600 GJ/（hm2·a）,居第二代乙醇燃料首位。因此,目前的首要任務就是構(gòu)建木質(zhì)纖維素生物能源的精煉加工。在多種生物能源作物中,柳枝稷已具有潛力成為高NEB作物[17-19]。

3 柳枝稷的栽培與管理

柳枝稷的生物質(zhì)產(chǎn)量主要受栽培方式、栽培時間以及地理位置的影響,但播種方式與生物技術(shù)方法也同樣會影響其產(chǎn)量[20]。對于不同生態(tài)類型的柳枝稷需選擇性種植。Hopkins等[21]指出原始的種植緯度會影響到種植于不同緯度的柳枝稷產(chǎn)量。因此,在改良品種的同時,需考慮到其特異地理位置的種群選擇性。肥料管理以及收獲時期等因素都影響著生物質(zhì)能的產(chǎn)量,這些同樣直接關系到柳枝稷的成活率、產(chǎn)量、種子品質(zhì)以及經(jīng)濟回收[22]。而且,這些因素很可能會與土壤和氣候相互作用對柳枝稷產(chǎn)量產(chǎn)生短期或長期影響。

基因型與環(huán)境的協(xié)同作用對于柳枝稷產(chǎn)量有至關重要的影響。Hopkins等[21]曾報道柳枝稷的抽穗期及產(chǎn)量與環(huán)境和基因型密切相關,并指出抽穗期過早將會導致產(chǎn)量的降低。另外,雨季的提前也可對品種產(chǎn)生積極的影響,但不顯著。基因型成熟化的品種在土壤中扎根較深,故在旱季亦可獲得較高產(chǎn)量[19,22]。

土壤類型與氮肥施用量對柳枝稷產(chǎn)量有重要影響,土壤濕度、持水能力作為產(chǎn)量的影響因素,尤其是對那些不耐旱品種的影響顯著。研究[22-24]表明,在美國德克薩斯州,嚴重干旱地帶柳枝稷的產(chǎn)量與植株高度極大地受到了影響。土壤濕度通常也會同收獲頻率或是氮肥施用量等管理因素協(xié)同作用來影響產(chǎn)量。Fike等[25]報道,濕潤土壤可提高早熟品種產(chǎn)量,但對于刈割一次的栽培系統(tǒng),濕潤土壤對產(chǎn)量變化的影響并不明顯。Stout等[26]的研究表明,當降水缺乏的時候,土壤持水能力就會限制產(chǎn)量,此時,氮是影響柳枝稷產(chǎn)量的首要因素。Vogel等[27]和Mulkey等[28]的試驗也證明,當?shù)适┯昧坑?0 kg/hm2增至 120 kg/hm2時,柳枝稷產(chǎn)量提高28%。CRP項目[26]建議56 kg/hm2為有效施用量,但還需因地域不同、環(huán)境不同而進行相應調(diào)整。

4 生物技術(shù)方法改良柳枝稷

新型可靠的生物技術(shù)方法對于降低生物能源成本可起到至關重要的作用,尤其是對于以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇的作物。核心問題包括引種馴化,克服抗性、纖維素的有效降解,提高生物質(zhì)含量以及乙醇的產(chǎn)率[29]。

4.1木質(zhì)素生物合成的修飾 降低木質(zhì)素的生物合成能夠提高糖化作用效率[30-32]。目前研究表明,有2種方法可以對木質(zhì)素進行修飾。其一,同化木質(zhì)素結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素的含量與結(jié)構(gòu)同等重要,盡管在木質(zhì)素分餾過程中,兩者相互作用才能夠使反應充分,但更為一致的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)會有利于細胞壁的降解,從而高效產(chǎn)出燃料乙醇。其二,如果纖維素含量低于閾值范圍,預處理過程就可略去,這樣能夠加強下游酶的糖化作用以及提高發(fā)酵效率[33]。因此,經(jīng)過木質(zhì)素修飾的柳枝稷能夠提高將生物質(zhì)轉(zhuǎn)換為發(fā)酵糖的效率。

4.2非生物脅迫抗性 水質(zhì)的優(yōu)劣以及其他一些非生物脅迫均可限制生物質(zhì)產(chǎn)量,因此,抗逆性狀對于柳枝稷在不能種植作物的邊緣土地上生長的適應性就凸顯的更為重要。干旱、重金屬、鹽、冷以及熱脅迫都會引發(fā)作物相應的反應,而每種脅迫也會引發(fā)不同的基因改變[34]。耐鹽堿、抗旱的上游通道已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中良好地表達出來[35-37]。但是,到目前為止只有有限的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇棺魑锍晒Φ乇憩F(xiàn)出非生物脅迫適應性。

對于能源作物的非生物脅迫抗性的研究應從兩方面入手。第一,不同作物基因型的不同不應局限在實驗室研究中,還應進行大田實驗,這些都將為育種與基因工程奠定基礎。實際上,柳枝稷在栽培過程中的不同表型已表現(xiàn)出對于水質(zhì)以及寒冷狀況的脅迫適應性。但植物對于水質(zhì)、冷害以及抗鹽性表現(xiàn)出復雜的綜合生理反應,同屬不同種或同種不同品種間往往表現(xiàn)出很大的差異,即使同一品種對逆境的抗性也會隨著生育期的不同而變化。因此對于柳枝稷非生物脅迫抗性的研究應結(jié)合不同品種、不同生育時期和不同土壤條件下的多項形態(tài)、生理指標及農(nóng)藝性狀進行辨別[34,38-39]。其次,對于模式品種的基礎研究應用在大田作物中,模式品種中確認的關鍵脅迫應答基因應通過基因修飾應用于柳枝稷的能源作物中。

4.3增加產(chǎn)量以及生物質(zhì)能源生成的方法首先,對于控制作物體系結(jié)構(gòu)的分子機制應有準確的了解。對于目前的田間研究可轉(zhuǎn)換為對生物能源原料體系結(jié)構(gòu)特點改變的研究中。例如,通過分子生物技術(shù)手段獲得矮稈、直立的作物,從而提高產(chǎn)量。另外,通過對細胞壁生物合成基因的修飾以及酶修飾也可提高生物質(zhì)能的產(chǎn)量。纖維素合成的過度表達會相應地提高木質(zhì)纖維素的生物合成[40]。生物質(zhì)能源的生成也可通過對作物的荷爾蒙應答基因修飾來提高[41-44]。

5 將柳枝稷轉(zhuǎn)換為生物燃料的工藝研究

來源于諸如木材、牧草以及農(nóng)業(yè)或林業(yè)廢棄物中的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)的乙醇燃料作為運輸燃料大大地降低了人類對于汽油進口的依賴,同時降低了貿(mào)易赤字的不平衡性,改善了城市空氣質(zhì)量,減少了大氣中CO2帶來的污染,并提供了一個可以促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的新型市場。同步糖化發(fā)酵[45]目前已成為將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化為乙醇燃料的首選方法,這種方法提高了能量的轉(zhuǎn)化率以及乙醇的產(chǎn)量,與此同時也降低了濃縮乙醇的投入成本。

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)原料中纖維素的水解可使糖類降解以便進一步將其發(fā)酵生成乙醇。在目前的發(fā)酵技術(shù)中,木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的成本相對較高,產(chǎn)量較低,而且水解過程的耗費也大。目前大量實驗都致力于改進木質(zhì)纖維素原料的水解過程。在預處理過程中,將半纖維素與木質(zhì)素移除能夠明顯地促進纖維素的水解。對纖維素酶的優(yōu)化以及酶負載亦可改善水解過程。同步糖化發(fā)酵能夠有效地去除葡萄糖帶來的對纖維素活性抑制,從而增加乙醇產(chǎn)量并加速纖維素水解效率[46]。

微生物、酵母以及真菌的發(fā)酵效率主要表現(xiàn)在其對于木質(zhì)纖維素水解的抑制過程中。木質(zhì)纖維素水解類型的不同,抑制劑成分也會發(fā)生相應的改變,導致微生物發(fā)酵結(jié)果各不相同。制約微生物發(fā)酵的參數(shù),諸如pH值、溫度以及營養(yǎng)素應在發(fā)酵過程中予以考慮。在發(fā)酵工程中,不僅微生物的特性要作為重要指標考慮,諸如間歇式培養(yǎng),細胞回收的連續(xù)式培養(yǎng)以及原位乙醇的移除等發(fā)酵過程選擇也尤為重要[47]。

目前用于同步糖化發(fā)酵過程中的細菌主要有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、粗糙脈孢菌（Neu-rospora crassa）,這些都可直接發(fā)酵纖維素生成乙醇,但產(chǎn)率不高,還要排除纖維素結(jié)晶度帶來的影響。其中,尖孢鐮刀菌在 34℃厭氧發(fā)酵 20和 50 g/L纖維素,可分別獲得9.6和14.5 g/L的乙醇,其理論產(chǎn)量分別為89.2%和53.2%。而粗糙脈孢菌發(fā)酵1%微晶纖維素和2%堿處理過的纖維素4 d可分別獲得5.5和10 g/L的乙醇,其轉(zhuǎn)化率分別為100%和90%[44,48-49]。

6 結(jié)論與展望

生物能源的未來期待著更多技術(shù)性的突破。諸如細胞壁生物合成,產(chǎn)物代謝等基因研究與通路研究更應作為基礎性研究而加以重視。對于生物燃料的應用則需要生物翻譯系統(tǒng)的幫助?！敖M學”技術(shù)對于不同發(fā)展階段相對應的細胞壁結(jié)構(gòu)與特點的基因、蛋白質(zhì)以及代謝的研究具有指導作用,可幫助進一步改進原料種子的適應性。

我國對于能源作物柳枝稷的研究還處于初級階段,根據(jù)對柳枝稷的生長研究,柳枝稷的能源利用應著重發(fā)展在諸如沙漠化、鹽堿地等邊緣土地。力求不占用糧食用地,最大化利用邊緣土地。對于柳枝稷的品種適應性改良、栽培以及育種方面的實驗研究首當其沖。目前主要任務是增強品種適應性,提高產(chǎn)量與生物質(zhì)產(chǎn)率,擴大栽培面積,從而進一步研究不同微生物在生物質(zhì)后期同步糖化發(fā)酵過程中的利用情況,逐步使生物能源作物向工業(yè)化、商業(yè)化發(fā)展,而成為新型清潔生物能源。

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