張珊珊，朱文嫻，趙曉紅，劉紹鵬

(1.徐州空軍學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083；3.中國礦業(yè)大學(xué) 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室，江蘇 徐州 221008)

超臨界CO2萃取北方地區(qū)早園竹葉中總黃酮的工藝優(yōu)化

張珊珊1，朱文嫻1，趙曉紅2，劉紹鵬3

(1.徐州空軍學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083；3.中國礦業(yè)大學(xué) 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室，江蘇 徐州 221008)

研究超臨界CO2流體萃取法提取北方地區(qū)早園竹葉中黃酮的工藝。通過單因素試驗確定影響總黃酮得率的主要因素及其最佳水平范圍，并通過正交試驗確定最佳萃取條件。結(jié)果表明：萃取溫度36℃、乙醇體積分數(shù)50%、萃取壓強35MPa、夾帶比9%、萃取時間40min，在此條件下總黃酮得率可達到23.24mg/g?？梢赃\用超臨界CO2流體萃取技術(shù)對竹葉黃酮進行提取，且提取效率較高。

竹葉；超臨界CO2流體萃??；總黃酮；提取

竹子是禾本科多年生常綠植物，是當今世界上最具有使用價值的植物之一，全世界約有70多屬，1200多種，竹林面積約20000萬hm2(約3億畝)[1]。近年來的研究表明，竹葉中含有大量的黃酮、酚酸、蔥醒、多糖、香豆素類、特種氮基酸、芳香成分和錳、鋅、硒等微量元素[2]。已有的研究表明，竹葉黃酮的藥理作用與銀杏黃酮相似[2]。對竹葉黃酮主要組成成分和主要藥理活性研究已有報道，結(jié)果表明其具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化、清除羥自由基、調(diào)節(jié)血脂及明顯的抑菌作用[3-4]。竹葉黃酮制劑以C-糖苷黃酮為主，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親水性強、能深入病灶部位等特點，工藝品質(zhì)優(yōu)良，適宜于多種藥物劑型的開發(fā)[5]?，F(xiàn)對竹葉黃酮的提取方法比較多樣[6-9]但利用超臨界流體萃取技術(shù)對黃酮提取的報道較少。

本實驗采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)萃取竹葉黃酮，找出最優(yōu)的提取條件，為對北方地區(qū)竹葉資源的利用及竹葉黃酮工業(yè)化生產(chǎn)工藝的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早園竹，2006年11月采摘于北京市鷹山森林公園。

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉 北京化工廠；亞硝酸鈉 上海試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；超臨界流體萃取設(shè)備 日本Jasco公司；FW-100萬用植物樣品粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；5804R冷凍離心機 德國Eppendonf公司；LA612型超純水系統(tǒng) 美國Pall公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；加熱磁力攪拌器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準液的配制[10]

準確稱取蘆丁標準品0.0273g(含量91.7%)于30%乙醇溶液溶解，定容至25mL準確吸取標準液0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4mL分別置于10mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3mL搖勻，放置6min，加10% Al(NO3)3溶液0.3mL搖勻，放置6min，加入4% NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容并搖勻，放置10min。置比色皿中在波長400～600nm之間測定吸收光譜，確定最大吸收波長為510nm，在510nm條件下測定吸光度。

1.3.2 竹葉總黃酮的萃取

萃取竹葉黃酮工藝：竹葉→曬干→80目過篩→超聲輔助提取→過濾→定容→定量分析。

采摘的竹葉自然風(fēng)干5d，分別用粉碎機粉碎，80目過篩后分裝于廣口瓶，于烘箱55℃烘10h。待提取。

1.3.3 提取樣液測定與黃酮類物質(zhì)提取量的計算

將提取液無損轉(zhuǎn)入10、25、50、100mL容量瓶(以提取液的量為標準)，并以相應(yīng)的浸提溶劑定容，然后移取0.50mL分別用上述蘆丁標準液顯色劑加入方法加入試劑，于波長510nm處測定吸光度。由回歸方程計算出測定樣品液黃酮質(zhì)量濃度，經(jīng)計算得出提取竹葉干樣所得黃酮類物質(zhì)的量。根據(jù)下式計算總黃酮得率。

1.3.4 最佳提取條件的確定

采用正交試驗來確定竹葉總黃酮類物質(zhì)最佳提取條件，采用L16(45)正交試驗表，分別以萃取溫度、萃取壓強、萃取時間、乙醇體積分數(shù)和夾帶劑在流體中比例(乙醇流速:CO2流速)這5個主要因素進行正交試驗。各設(shè)置4水平試驗，以確定竹葉總黃酮物質(zhì)的最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 工作曲線與線性回歸方程

對1.3.1節(jié)配制的蘆丁標樣溶液的不同質(zhì)量濃度在波長510nm處測定吸光度，得標準曲線方程：Y=1.1442X＋0.0237，R2=0.9989。

2.2 影響總黃酮得率的單因素條件的確定

2.2.1 壓強對總黃酮得率的影響

準確稱取0.3g竹粉放于萃取釜中，分別在16、20、24、28、32、36MPa的萃取壓強下，其他參數(shù)為固定值進行萃取，即：萃取溫度40℃、夾帶劑為無水乙醇、夾帶比3%(乙醇流速:CO2流速=0.15mL/min:5mL/ min)、萃取時間20min+5min(劑萃取時間20min后，關(guān)閉夾帶劑，繼續(xù)用CO2萃取5min，使萃取釜中前期提取物質(zhì)全部進入收集管中)；定容，冷凍干燥后，復(fù)溶，按1.3.1節(jié)進行顯色處理；測定吸光度，計算竹葉總黃酮得率，并繪制提取率與萃取壓強的關(guān)系圖，見圖1。

圖1 提取壓強對竹葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of pressure on extraction rate of total flavonoids

根據(jù)圖1可見，黃酮類物質(zhì)隨壓強的升高，總黃酮得率也相應(yīng)提高，在壓強32MPa時最高總黃酮得率為4.52mg/g。這是由于隨壓強的增大，超臨界流體的密度提高，對竹葉黃酮的夾帶能力增大，從而使總黃酮得率升高。除壓強條件在16～20MPa之間未出現(xiàn)顯著性差異，其他條件之間均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。

2.2.2 溫度對總黃酮得率的影響

圖2 提取溫度對竹葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of total flavonoids

準確稱取0.3g竹粉放于萃取釜中，分別在32、36、40、44、48℃萃取溫度下，其他參數(shù)為固定值進行萃取，即萃取壓強28MPa、夾帶劑為無水乙醇、夾帶比3%；萃取時間20min＋5min；定容，冷凍干燥后，復(fù)溶，按1.3.1節(jié)進行顯色處理；測定吸光度，計算竹葉總黃酮得率。以總黃酮得率為縱坐標、溫度為橫坐標，繪制提取率與萃取溫度的關(guān)系圖，見圖2。

由圖2可見，竹葉黃酮在CO2中的溶解度隨著溫度的增加而降低，當萃取溫度從36℃上升至48℃時，萃取物中的竹葉黃酮的提取率隨溫度的上升而呈下降趨勢在36℃時，最高總黃酮得率為7.48mg/g。五種條件之間均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。在相同壓強下，由于溫度的上升使得CO2流體的密度降低，故使其對竹葉黃酮的夾帶能力下降。

2.2.3 夾帶劑在流體中比例對黃酮得率的影響

準確稱取0.3g竹粉放于萃取釜中，分別以1%、3%、5%、7%、9%的夾帶劑比例(乙醇流速: CO2流速)，其他參數(shù)為固定值進行萃取，即：萃取壓強28MPa、萃取溫度40℃、夾帶劑為無水乙醇、萃取時間20min+5min；定容，冷凍干燥后，復(fù)溶，按1.3.1節(jié)進行顯色處理；測定吸光度，計算竹葉總黃酮得率，以總黃酮得率為縱坐標、夾帶此夾帶劑在流體中比例為橫坐標，繪制提取率與萃取夾帶比的關(guān)系圖，見圖3。

圖3 夾帶比對竹葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of entrainer amount on extraction rate of total flavonoids

由圖3可見，夾帶比由1%升至9%時，黃酮類物質(zhì)隨夾帶劑流量的升高，總黃酮得率也增高，在夾帶比為9%時最高總黃酮得率為12.35mg/g。除夾帶比為3%～5%之間沒有出現(xiàn)顯著性差異，其他條件之間均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)由于竹葉黃酮是具有極性的物質(zhì)，所以有機溶劑作為夾帶劑的加入更有利于提取。

2.2.4 時間對黃酮得率的影響

準確稱取0.3g竹粉放于萃取釜中，分別提取10、20、30、40、50min，其他參數(shù)為固定值進行萃取，即：萃取壓強28MPa、萃取溫度40℃、夾帶劑為無水乙醇、夾帶比3%；定容，冷凍干燥后，復(fù)溶，按1.3.1節(jié)進行顯色處理；測定吸光度，計算竹葉總黃酮得率，以總黃酮得率為縱坐標、時間為橫坐標。繪制總黃酮得率與萃取時間的關(guān)系圖，見圖4。

圖4 提取時間對竹葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖4可見，隨著時間的延長，總黃酮得率也增高，在提取50min時最高提取效率5.32mg/g。6種條件之間均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。

2.2.5 夾帶劑的乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

取竹粉0.3g放入萃取釜中，分別以0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%體積分數(shù)乙醇溶液作為夾帶劑，其他參數(shù)為固定值進行萃取，即：萃取溫度40℃、萃取壓強28MPa、夾帶比3%、萃取時間20min＋5min；定容，冷凍干燥后，復(fù)溶，按1.3.1節(jié)進行顯色處理，測定吸光度，計算竹葉總黃酮得率。以總黃酮得率為縱坐標、夾帶劑乙醇體積分數(shù)為橫坐標，繪制總黃酮得率與夾帶劑乙醇體積分數(shù)的關(guān)系圖，見圖5。

圖5 夾帶劑乙醇體積分數(shù)對竹葉總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖5可見，不同體積分數(shù)乙醇對黃酮類物質(zhì)的夾帶能力是有所區(qū)別的，乙醇體積分數(shù)由10%升至50%時，總黃酮得率隨乙醇體積分數(shù)的增加而增加，當乙醇體積分數(shù)達到50%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮得率反而下降。在50%乙醇溶液作為夾帶劑時，最高總黃酮得率為11.03mg/g。乙醇體積分數(shù)0和10%、20%和30%、60%和70%條件之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其他條件之間均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 超臨界CO2流體萃取最佳提取條件的確定

通過單因素試驗確定影響總黃酮得率的主要因素及其最佳水平范圍，選用萃取溫度、萃取壓強、萃取時間、乙醇體積分數(shù)和夾帶比(乙醇流速: CO2流速)這5個主要因素進行正交試驗，以全面研究這5因素4水平的交叉作用對竹葉總黃酮得率的影響。各因素水平如表1所示。選用正交試驗表進行試驗設(shè)計，以竹葉總黃酮得率為試驗指標，通過對結(jié)果的分析確立最佳提取條件。準確稱取一定量備好的新生竹粉、將其放入超臨界CO2萃取設(shè)備的萃取釜中，調(diào)節(jié)萃取溫度、萃取壓強、萃取時間、夾帶劑、夾帶比(夾帶劑流速: CO2流速)等參數(shù)條件萃取竹葉黃酮，萃取液定容，測其吸光度，計算總黃酮得率。

表1 最佳提取條件正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

綜上所述，選用萃取溫度、萃取壓強、萃取時間、乙醇體積分數(shù)和夾帶比(乙醇流速:CO2流速)這5個主要因素進行正交試驗。選用正交試驗表進行試驗設(shè)計，試驗水平由單因素試驗結(jié)果確定范圍，以竹葉總黃酮得率為指標。試驗結(jié)果及極差分析見表2。

表2 早園竹葉總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and results

表3 各因素方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal array design experimental results

由表2極差分析和表3方差分析可以看出各因素對總黃酮得率影響的主次順序為D＞A＞E＞B＞C，即夾帶比＞乙醇體積分數(shù)＞萃取壓強＞萃取溫度＞萃取時間。5種因素對總黃酮得率的影響趨勢與單因素試驗結(jié)果所示趨勢相同。其中夾帶比、乙醇體積分數(shù)、萃取溫度、萃取時間對試驗結(jié)果影響具有顯著性差異(P＜0.05)，萃取壓強對試驗結(jié)果影響不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

確定最佳萃取條件為A2B3C2D1E3，即萃取溫度36℃、乙醇體積分數(shù)50%、萃取壓強35MPa、夾帶比9%、萃取時間40min。

2.4 驗證實驗

將正交試驗得到的最佳條件進行驗證，在該條件下重復(fù)萃取3次實驗，計算總黃酮得率。

在上述樣品中，分別加入0.4 mL蘆丁標準品(0.5mg/mL)，按1.3.1節(jié)溶液制備方法，分別測定吸光度，計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 最佳提取率及加標回收率Table 4 Optimal extraction rate of total flavonoids and recovery rates in spiked samples

從表4可以看出，該方法的總黃酮平均得率為23.24mg/g，比正交表中最佳總黃酮得率(19.29mg/g)高20.48%。平均回收率在98.56%，說明本實驗使用的分析方法準確度較高。

3 討 論

文獻[10]中報道不同竹葉總黃酮含量在1.18%～2.02%之間，而本實驗中提取效率經(jīng)換算約為2.32%。其原因可能是超臨界CO2流體萃取技術(shù)有利于黃酮物質(zhì)的溶出；竹子源產(chǎn)地為中國南方，為了適應(yīng)北方寒冷的氣候，需產(chǎn)生較多生物活性物質(zhì)對抗寒冷[11]。由于目前北方地區(qū)竹葉中黃酮含量還沒有文獻記載，推測試驗原料的采集時間(冬天)和竹子生長地區(qū)對竹葉中黃酮類物質(zhì)的含量有較大影響。接下來需要進行同品種的竹葉在不同季節(jié)、不同生長區(qū)的竹葉黃酮含量比較實驗研究以論證推測。

采用有機試劑從植物組織中提取黃酮物質(zhì)的方法已經(jīng)成熟。該方法的應(yīng)用對象廣泛，而且具有良好的回收率，但應(yīng)用于商業(yè)目的時有一些明顯的缺點，如成本較高、萃取試劑的毒性所引起的產(chǎn)品安全性問題、提取時間長等。超臨界流體萃取技術(shù)與傳統(tǒng)的溶劑萃取相比具有一些明顯的優(yōu)點，如操作成本低、萃取效率高、操作簡單和無毒無污染等。本研究探討利用超臨界流體萃取技術(shù)從竹葉中制備黃酮。結(jié)果表明，利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從竹葉中制備黃酮類物質(zhì)是完全可行的。

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Process Optimization for Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Total Flavonoids from Praecox Leaves in Northern Areas

ZHANG Shan-shan1，ZHU Wen-xian1，ZHAO Xiao-hong2，LIU Shao-peng3
(1. Xuzhou Air Force College, Xuzhou 221000, China；2. College of Art and Science, Beijing Union University, Beijing 100083；3. Key Laboratory of Coal Processing and Efficient Utilization, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221008, China)

Supercritical CO2fluid extraction technique was explored to extract total flavonoids from praecox leaves in northern areas of China. Single-factor design was used to determine main variables that influence extraction rate of total flavonoids. The optimal extraction conditions were achieved to be extraction temperature of 36 ℃, ethanol concentration of 50%, extraction pressure of 35 MPa, entrainer (absolute ethanol) amount of 1:15, entrainer amount 9% and extraction time of 40 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total flavonoids was 23.24 mg/g. The supercritical fluid CO2extraction can be used for the extraction of total flavonoids from praecox leaves with high extraction efficiency.

praecox leaves；supercritical fluid CO2 extraction；total flavonoids；extraction

O623.54

A

1002-6630(2011)06-0142-05

2010-05-17

張珊珊(1982—)，女，助教，碩士，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：zss_1982@126.com