李保深 高大文 張博

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

纖維素是地球上最古老、最豐富的天然高分子，是人類最寶貴的天然可再生性資源。全世界每年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈近2 000億t。我國(guó)屬于農(nóng)業(yè)大國(guó)，桔桿年產(chǎn)超過(guò)6億t［1］，大部分作為廢棄物被丟棄，不但帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，也浪費(fèi)了寶貴的物質(zhì)資源。玉米秸稈是纖維素組分含量很高的農(nóng)作物殘留物，如何使玉米秸稈無(wú)害化、資源化已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2－4］。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶水解秸稈，具有效果穩(wěn)定及污染少等優(yōu)點(diǎn)，因而得到了普遍的認(rèn)可和推崇［5］。因此，篩選和分離出高產(chǎn)纖維素酶的微生物種類，研究其對(duì)纖維素物質(zhì)的降解能力，對(duì)減輕農(nóng)業(yè)廢棄物給環(huán)境的壓力和纖維素資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義?？山到饫w維素的微生物包括真菌、細(xì)菌和放線菌，研究較多的有曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)和纖維弧菌屬(Cellvibrio)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)等［6］。本研究在大量采集樣品的基礎(chǔ)上，從自然環(huán)境中反復(fù)分離篩選，獲得了1株具有較高產(chǎn)酶能力和降解活性的菌株，并研究了其對(duì)玉米秸稈的降解能力，以期為提高玉米秸稈的利用率提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品來(lái)源于黑龍江省園藝分院林場(chǎng)腐木土樣，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校外玉米秸稈腐殖物，哈爾濱市南崗區(qū)玉米耕種地土樣，東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)腐木土樣，馬家溝東北林業(yè)大學(xué)段河道內(nèi)土樣，哈爾濱市南崗區(qū)玉米耕種地玉米秸稈樣品。將玉米秸稈剪成1～2 cm，加入4%的NaOH溶液浸泡24 h，過(guò)濾并用沸水洗至中性，在75℃烘干至恒質(zhì)量，121℃高壓蒸汽處理15 min，烘干后待用。用于試驗(yàn)的培養(yǎng)基包括:①初篩培養(yǎng)基。經(jīng)改良后的察氏培養(yǎng)基，其中以羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)取代察氏培養(yǎng)基中的蔗糖，其他成分不變。②復(fù)篩培養(yǎng)基［7］。CMC－Na 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉10 g/L，定容1 L。③搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基［8］。CMC－Na 7.5 g/L，(NH4)2SO44 g/L，蛋白胨5.0 g/L，吐溫80 0.18 mL，MgSO43.0 g/L、CaCl23.0 g/L，微量Fe-SO4，自然pH。④玉米秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基。經(jīng)堿預(yù)處理的玉米秸稈5 g/L代替搖瓶培養(yǎng)基中的CMC－Na，其他成分同搖瓶培養(yǎng)基。

1.2 分析方法

將純培養(yǎng)菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，用移液槍吸取1 mL發(fā)酵液離心(9 000 r/min，5 min)，上清液即為粗酶液。

酶活力的測(cè)定:①濾紙?zhí)腔Φ臏y(cè)定。取粗酶液0.5 mL，加入醋酸—醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，然后加入一張(1 cm×6 cm)新華1號(hào)濾紙，50℃恒溫水浴1 h后，立即按DNS法測(cè)定還原糖［9－10］(加入3 mL DNS顯色液，沸水浴中顯色10 min后，快速冷卻終止反應(yīng)，定容至25 mL，540 nm處測(cè)定OD值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活)。②內(nèi)切纖維素酶的測(cè)定。取粗酶液0.5 mL，加入含1%CMC－Na的醋酸—醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，經(jīng)50℃恒溫水浴30 min后，立即用DNS法測(cè)定還原糖。③外切纖維素酶的測(cè)定。取粗酶液0.5 mL，加入含2%Avicel的醋酸—醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，50℃恒溫水浴2 h，立即按DNS法測(cè)定還原糖。④β－葡萄糖苷酶的測(cè)定。取粗酶液0.5 mL，加入含0.5%水楊苷的醋酸—醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，50℃恒溫水浴30 min，立即按DNS法測(cè)定還原糖。

剛果紅染色法:將初篩菌株接種至復(fù)篩培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～4 d，加入1.0 g/L的剛果紅溶液，浸染1 h棄去染液，加入1 mol/L的NaCl溶液，洗滌脫色1 h，測(cè)菌落直徑(d，cm)和水解圈直徑(D，cm)，用D/d表示水解能力。

酶活定義:在反應(yīng)條件為50℃，pH值4.8下，定義每1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位，用IU/mL表示。

菌株的鑒定:①菌株形態(tài)鑒定。將獲得的菌株接種于平板培養(yǎng)基中，恒溫28℃培養(yǎng)2 d，菌體經(jīng)掃描電鏡成像，結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》［11］和中國(guó)真菌志:青霉屬及其相關(guān)有性型屬，從菌株生長(zhǎng)特性和形態(tài)進(jìn)行鑒定。②18S rDNA分析。將樣品接入搖瓶培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min培養(yǎng)3 d，取適量菌株發(fā)酵液稀釋，封裝于10 mL離心管中。真菌18S rDNA通用引物合成和測(cè)序由Genscript公司完成。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后，運(yùn)用MEGA3.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［12］。菌株都快，在第3天即鋪滿平板，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)和存活能力，因此選定菌株C5作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

圖1 菌株C5剛果紅染色產(chǎn)生的透明圈

表1 真菌水解能力及最高酶活

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)采集的樣品進(jìn)行劃線分離、篩選和純化，得到19株菌株。將獲得的真菌進(jìn)行剛果紅染色水解圈的測(cè)定，其中有12株真菌產(chǎn)生明顯的水解圈，其中，菌株C5產(chǎn)生的水解圈最明顯(圖1)，D/d=2.948均高于其他菌株產(chǎn)生的水解圈，表明其具有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶的能力。

將產(chǎn)生明顯水解圈的12株菌株，接入復(fù)篩培養(yǎng)基，經(jīng)DNS法測(cè)定濾紙酶活力，最高濾紙酶活力見(jiàn)表1。由表1可以看出，菌株C5和C17的濾紙酶活力高于其他菌株，分別為7.405、6.512 IU/mL，并且其具有較大的剛果紅水解圈，其中菌株C5產(chǎn)酶速率較C17快4d，菌株C5在平板上生長(zhǎng)較其他

2.2 菌株C5的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株C5在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，菌落呈圓形，邊緣平整有白色菌絲，表面粗糙，呈灰綠色，布滿一層分生孢子粉，菌落背面茶棕色(圖2(a))。掃描電鏡圖片顯示，菌絲有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈橢圓形或球形(1.0～1.5 μm)，不對(duì)稱分支2～5個(gè)，排列緊密，呈掃帚狀(圖2(b))，其頂端著生5～10個(gè)短小瓶狀小梗(10.0～15.0 μm)，呈不分枝的鏈狀(圖2(c))。根據(jù)菌落形態(tài)觀察及掃描電鏡鏡檢結(jié)果，參照《真菌鑒定手冊(cè)》和中國(guó)真菌志:青霉屬，初步判定菌株C5為青霉屬(Penicillium sp.)。

圖2 真菌C5形態(tài)照片

2.2.2 18SrDNA基因序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得菌株C5的ITS序列，大小為1 769 bp，登陸號(hào)為HQ455812。將該序列結(jié)果輸入GenBank以BLAST進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果顯示其18S rDNA序列與青霉屬(Penicillium sp.)相似性最高，相似度達(dá)到99%。運(yùn)用MEGA3.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3，比例尺為核酸分離度(0.1%)，分支處數(shù)字為支持率。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為斜臥青霉(Penicillium decumbens)。

將菌株C5接入玉米秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，間隔24 h測(cè)定菌株C5纖維素酶活，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 基于ITS序列同源性菌株C5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 菌株C5纖維素酶活力

由表2可知，菌株C5在以玉米秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)至第3天，濾紙酶活最高，為7.085 IU/mL，內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β－葡萄糖苷酶最高值分別為3.856、2.681、1.487 IU/mL。

2.3.2 秸稈降解情況

測(cè)定酶活結(jié)束后，將培養(yǎng)基過(guò)濾、風(fēng)干，取過(guò)濾物進(jìn)行掃描電鏡成像試驗(yàn)，觀察秸稈樣品物理形變，研究真菌C5對(duì)玉米秸稈的降解能力。

由圖4可知，未處理的玉米秸稈表面光滑，結(jié)構(gòu)緊密，秸稈分布著氣孔，因自然風(fēng)干作用，表面有龜裂現(xiàn)象(圖4(a))，經(jīng)堿預(yù)處理后，玉米秸稈復(fù)雜的表面結(jié)構(gòu)變得較為清晰，表層的木質(zhì)素被完全剝離，露出縱向排列的纖維素骨架(圖4(b))，根據(jù)波爾頓克模型［13］，可以推測(cè)纖維素束之間的結(jié)構(gòu)也變得較為疏松，更容易與纖維素酶的活性位點(diǎn)接觸。經(jīng)菌株發(fā)酵利用后，纖維素從中間斷裂、破碎，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)普遍發(fā)生了明顯的變化(圖4(c))，主要是因?yàn)榻臃N菌株在培養(yǎng)過(guò)程中利用纖維素進(jìn)行代謝，導(dǎo)致玉米秸稈纖維素被降解。

2.3 菌株C5秸稈降解效果

2.3.1 纖維素酶活力

圖4 不同階段秸稈樣品的掃描照片

3 結(jié)論與討論

在大量采集樣品的基礎(chǔ)上，從自然環(huán)境中分離篩選獲得19株菌，進(jìn)一步篩選得到1株纖維素酶活力高和產(chǎn)酶速率快的菌株C5，經(jīng)鑒定菌株C5為斜臥青霉菌(Penicillium decumbens)。該菌株具有較全的酶系和較好的產(chǎn)酶能力，對(duì)玉米秸稈纖維素有很好的降解效果，培養(yǎng)4 d時(shí)濾紙酶活和內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β－葡萄糖苷酶分別為7.085、3.856、2.681、1.487 IU/mL。劉清鋒［14］等研究青霉T24－2的產(chǎn)酶特性，在自然pH值下，30℃、130 r/min，發(fā)酵4 d該菌株的內(nèi)切葡聚糖酶和濾紙酶活最高，分別達(dá)到45.01、6.89 IU/mL;劉新育［15］等以斜臥青霉A50為試驗(yàn)菌株，添加麩皮7%進(jìn)行培養(yǎng)，菌株纖維素酶活為19.7 U/mL;劉星斌［16］等利用航天誘變黑曲霉ZM－8菌株固態(tài)發(fā)酵β－葡萄糖苷酶，培養(yǎng)時(shí)間為144 h，獲得β－葡萄糖苷酶酶活達(dá)到21.74 U/g;艾斌凌［17］等研究麩皮對(duì)里氏木霉Rut C－30產(chǎn)纖維素酶的促進(jìn)作用，獲得最高濾紙酶活為6.383 U/mL。本研究獲得的斜臥青霉C5在產(chǎn)酶能力和產(chǎn)酶速率方面與已報(bào)道的菌株進(jìn)行比較，其中濾紙酶活和內(nèi)切葡聚糖酶較高，而外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶較低，主要是因?yàn)槔w維素酶是一種多酶系，在分解纖維素物質(zhì)時(shí)屬于一個(gè)協(xié)同作用，酶系的后者依靠前者代謝作用的產(chǎn)物進(jìn)行代謝作用，同時(shí)酶系之間還存在著抑制作用，導(dǎo)致外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶較低;斜臥青霉C5在培養(yǎng)第3天即達(dá)到產(chǎn)酶高峰期，同已報(bào)道的斜臥青霉產(chǎn)酶速率對(duì)比有很大的提高。

目前，纖維素降解真菌的研究與應(yīng)用主要集中于酶系組成比較齊全、產(chǎn)酶量大的木霉屬、青霉屬、曲霉屬等，而青霉屬具有生長(zhǎng)快和易培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。因此，青霉屬具有很高的潛力和價(jià)值應(yīng)用于纖維素的降解，并被眾多學(xué)者用于降解纖維素的研究。已報(bào)道產(chǎn)纖維素降解酶系的青霉菌株，以斜臥青霉、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)和微紫青霉(Penicillium janthinellum)等菌株的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)［18－19］。也有關(guān)于草酸青霉產(chǎn)酶的報(bào)告，但酶活力不高［20］。

斜臥青霉C5是本研究獲得的纖維素酶活力最強(qiáng)的菌株，其酶活力和產(chǎn)酶速率均較高，而且擁有較完整的纖維素酶系，在降解玉米秸稈的過(guò)程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的水解能力，菌株C5是一株具有研究和開(kāi)發(fā)潛力的菌株。

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