姜云 陳長卿 王琳 馬貴龍

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

人參銹腐病(Cylindrocarpon destructans)是對人參根部危害最大的1種土傳病害，對人參產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大，常年發(fā)病率為24.9%～44.1%［1］，目前仍沒有較好的解決辦法，已成為人參連作的主要障礙。凡種過人參的土地，在幾十年內(nèi)不能再植參，否則大部分乃至整個參根都會腐爛［2-3］。近年來，用化學(xué)防治措施來防治人參銹腐病的結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到人們預(yù)想的效果，而且過量使用化學(xué)農(nóng)藥會破壞土壤的微生物環(huán)境，加重環(huán)境污染，也使得有毒物質(zhì)在參根內(nèi)大量積累，降低人參的商品價值，因此，人們把防治重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向生物防治措施和農(nóng)業(yè)防治措施上［4-5］。其中農(nóng)用抗生素由于其具有無污染、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)而成為重要的生物防治措施。農(nóng)用抗生素來源于微生物，特別是放線菌［6］。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約8 000種生物活性物質(zhì)中，近70%是由放線菌產(chǎn)生的［7］。本研究對采自吉林省人參主要種植區(qū)(集安市、通化市等)的土壤樣品進(jìn)行了拮抗放線菌的篩選［8］，對優(yōu)良菌株1a-3進(jìn)行了鑒定并對其培養(yǎng)配方和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，以便為抗生物質(zhì)的分離提純提供試驗依據(jù)，為進(jìn)一步的小試和中試生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑和儀器:試劑均為國產(chǎn)分析純;主要儀器為基恩士國際貿(mào)易有限公司的數(shù)碼顯微鏡(KEYENCE VHX-600)，太倉市實驗設(shè)備廠的恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQX100)，德國KONTRON公司的高速冷凍離心機(jī)(T-42K)，上海精密科學(xué)儀器有限公司的酸度計(PHS-3C)，Ultra-Violet Products Ltd公司的自動凝膠圖像分析儀(GelDoc-It 200)。

菌株及保存:菌株1a-3按常規(guī)方法在高氏一號培養(yǎng)基上繁殖保存。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(同種子培養(yǎng)基):每升含大豆粉20 g，葡萄糖10 g、NaCl 10 g、CaCO33 g、KH2PO41 g，pH值7.0。

1.2 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)觀察:①采用插片法［9］將菌株1a-3劃線接種在高氏一號培養(yǎng)基上，同時將滅菌的蓋玻片(1 cm×1 cm)斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)5 d后，取出蓋玻片在生物顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。②取在高氏一號平板上培養(yǎng)7 d的菌株1a-3進(jìn)行掃描電鏡樣品加工處理。樣品用3%戊二醛室溫下固定4～6 h，后經(jīng)系列丙酮脫水、CO2臨界點(diǎn)干燥、粘樣、鍍膜后在掃描電鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

培養(yǎng)特征和生理生化特征:參照《鏈霉菌鑒定手冊》［10］中推薦的部分培養(yǎng)基和方法進(jìn)行，28℃培養(yǎng)12～15 d后觀察記錄特征。

細(xì)胞壁化學(xué)成分分析:采用快速薄板層析法［11-12］對菌株1a-3的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞水解液氨基酸和糖型的分析。

分子鑒定:按照徐平的方法［13］提取菌株1a-3基因組DNA，采用通用引物［14］(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3';R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進(jìn)行16 S rDNA的PCR擴(kuò)增，經(jīng)回收、連接和轉(zhuǎn)化后，在測序儀上進(jìn)行測序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST分析比對，并選取相似性較高的菌株與菌株1a-3用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菌株發(fā)酵培養(yǎng)及抑菌活性的測定

菌株發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵上清液的制備:發(fā)酵培養(yǎng)首先在種子培養(yǎng)基上28℃振蕩培養(yǎng)24 h(150 r/min)制成種子液;然后加3 mL種子液在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中(30 mL)，于28℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min)72 h后，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

混菌法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性:將1 mL無菌水加入人參銹腐病菌的培養(yǎng)試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下制成菌懸液與PDA培養(yǎng)基10 mL混合后到入9 cm的培養(yǎng)皿中制成平板，用直徑1 cm的打孔器在固體平板中打孔，然后向孔中加入發(fā)酵上清液200μL，25℃培養(yǎng)3d后測定抑菌圈大小。

1.4 發(fā)酵條件的研究

不同碳、氮源對發(fā)酵液抑菌活性的影響:在氮源質(zhì)量濃度和其它培養(yǎng)條件不變的情況下［15］，分別用蔗糖、麥芽糖、甘油、正丁醇、玉米粉、淀粉等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖;在碳源質(zhì)量濃度和其它培養(yǎng)條件不變的情況下，分別用酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等量替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的大豆粉，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，采用混菌法測定不同碳、氮源的發(fā)酵上清液對C.destructans抑菌活性的影響。

碳、氮源單因子試驗和正交試驗:在確定主要碳、氮源的基礎(chǔ)上，對大豆粉(0～22 g/L，按2 g/L遞增)、葡萄糖(0～6 g/L，按1 g/L遞增)、酵母粉(0～0.5 g/L，按0.1 g/L遞增)、玉米粉(0～18 g/L，以1.5 g/L遞增)進(jìn)行單因子試驗，以確定其合適使用的質(zhì)量濃度梯度。在此基礎(chǔ)上選擇L9(34)的正交試驗進(jìn)行發(fā)酵抑菌試驗，因子水平見表1，發(fā)酵試驗重復(fù)3次，用混菌法測定抑菌活性，將3次的平均值作為試驗結(jié)果［16］，進(jìn)行分析和統(tǒng)計后確定發(fā)酵配方。

表1 基于L9(34)的發(fā)酵抑菌試驗的因子水平

培養(yǎng)條件的摸索:在確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分后測定不同培養(yǎng)條件下發(fā)酵液對C.destructans的抑菌活性，測定方法用混菌法，①種齡試驗。取30 mL種子培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基成分同發(fā)酵培養(yǎng)基，用直徑10 mm的打孔器打取1塊1a-3菌碟接入種子培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后，以10%的接種量將其分別接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中。②接種量試驗。在其它培養(yǎng)條件一致的條件下，將種子液分別以體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%和10%的水平接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定各搖瓶中發(fā)酵液的抑菌活性。③初始pH試驗。在其它培養(yǎng)條件一致的條件下，用酸度計將培養(yǎng)基的起始pH值(滅菌前pH值)分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0搖床培養(yǎng)后，測定各搖瓶中發(fā)酵液的抑菌活性。④發(fā)酵溫度試驗。在其它培養(yǎng)條件一致的條件下，分別在24、28、32℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，測量各搖瓶中發(fā)酵液的抑菌活性。⑤發(fā)酵時間試驗。在其它培養(yǎng)條件一致的條件下，發(fā)酵分別培養(yǎng)12～120 h(12 h遞增)，測定各搖瓶中發(fā)酵液的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株1a-3的孢子絲呈寬大頂端螺旋形，帶有長柄，孢子柱形，表面光滑，常在氣生菌絲上形成長孢子鏈(圖1)。

圖1 菌株1a-3的菌絲和孢子形態(tài)

2.1.2 培養(yǎng)特征和生理生化特征

菌株1a-3在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果見表2，其中在高氏一號培養(yǎng)基上氣生菌絲呈銀鼠灰色，菌落有水珠，長勢飽滿，基內(nèi)菌絲黃色，有可溶性色素產(chǎn)生。生理生化測定結(jié)果表明，菌株1a-3能使明膠液化，淀粉水解，牛奶凝固，產(chǎn)生H2S，但不能在纖維素上生長;耐鹽性結(jié)果表明，菌株1a-3只能忍受5 g/L以下的鹽脅迫，在7～25 g/L鹽脅迫培養(yǎng)基上不生長。

2.1.3 細(xì)胞壁化學(xué)成分

細(xì)胞壁化學(xué)成分分析顯示，菌株1a-3含LL-二氨基庚二酸和甘氨酸;無特征性糖，糖型C。因此其細(xì)胞壁化學(xué)組分屬于Ⅰ型，符合鏈霉菌(Streptomyces)的化學(xué)分類特性。

2.1.4 分子鑒定

菌株1a-3 16 S rDNA的PCR擴(kuò)增得到了1條1 500 bp左右大小的條帶，將測序所得的1 525 bp DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對，登錄號為HM560727。與其同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取8株模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，可以看出菌株1a-3與S.griseochromogenes(AB184387)聚于同一分支中，其相似性達(dá)到99%。

2.2 發(fā)酵條件

不同碳、氮源對發(fā)酵液抑菌活性影響:在供試的6種碳源中(表3)，除了淀粉為碳源時不產(chǎn)生抑菌圈外，其它碳源的抑菌活性都低于葡萄糖(對照)，在發(fā)酵過程中常選用速效碳源和緩慢碳源混合作為碳源，結(jié)合應(yīng)用成本考慮，選用葡萄糖與玉米粉復(fù)合使用，作為本試驗碳源。在供試的6種氮源中(表4)，以硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉為氮源時無抗菌物質(zhì)產(chǎn)生，對無機(jī)氮源的利用不好，而有機(jī)氮源中以大豆粉為氮源時產(chǎn)素能力最強(qiáng)，當(dāng)以酵母粉單獨(dú)作氮源時，抑菌效果雖然一般，但酵母粉有提供氮源又促進(jìn)發(fā)酵的雙重作用，所以選擇大豆粉和酵母粉作為氮源。

表2 菌株1a-3的培養(yǎng)特征

圖2 菌株1a-3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(分支處的數(shù)值為支持強(qiáng)度值)

表3 不同碳源對菌株1a-3產(chǎn)素的影響

表4 不同氮源對菌株1a-3產(chǎn)素的影響

碳、氮源單因子試驗和正交試驗結(jié)果表明，大豆粉按2 g/L遞增(2～6 g/L)、酵母粉按0.1 g/L遞增(0.2～0.4 g/L)、葡萄糖按1 g/L遞增(0～2 g/L)、玉米粉按1.5 g/L遞增(0～3 g/L)比較合適，每個因子3個水平，能反映出趨勢的變化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗，9次試驗的抑菌圈直徑依次為20、22、17、21、20、23、19、24、22 mm。極差分析結(jié)果(表5)表明:4因子對發(fā)酵液抑菌活性的影響大小依次為大豆粉、玉米粉、葡萄糖、酵母粉。最佳碳氮源發(fā)酵配方為大豆粉2 g/L、酵母粉0.3 g/L、玉米粉3 g/L、葡萄糖1 g/L。

2.3 培養(yǎng)條件

在確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分的條件下，對發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了摸索，首先是將種子培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，以6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng);培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基的起始pH為7.0，恒溫?fù)u床上28℃培養(yǎng)60 h，搖瓶裝量30 mL種子培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵后，其抑菌活性最好，所以選擇此培養(yǎng)條件作為發(fā)酵培養(yǎng)條件。

表5 正交試驗極差分析結(jié)果mm

3 結(jié)論與討論

絕大多數(shù)抗生素產(chǎn)生菌為鏈霉菌屬，其次是諾卡氏菌屬(Nocardia)、游動放線菌屬(Actinoplanes)以及馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)等，其中鏈霉菌已成為放線菌中數(shù)量最多、而且產(chǎn)生抗生素種類也最多的一個屬。本研究在傳統(tǒng)分類原則的基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)方法對目的生防菌株進(jìn)行了分類鑒定。菌株1a-3在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和細(xì)胞壁成分上與已知的灰產(chǎn)色鏈霉菌相似，并且結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最后歸為灰產(chǎn)色鏈霉菌。目前尚不能確定該菌株是否為1新種，還需要與模式種進(jìn)行生理生化性質(zhì)比較，并進(jìn)行DNA雜交，根據(jù)同源性作進(jìn)一步分析。另外，該菌株是否可被看作是農(nóng)用抗生素的一個新來源，還需要后續(xù)試驗的進(jìn)一步驗證。

發(fā)酵是抗生素產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，這是因為盡管抗生素產(chǎn)生菌的性能優(yōu)良，但若缺乏合理的發(fā)酵工藝，也不能將其潛力充分發(fā)揮?？股匕l(fā)酵除受營養(yǎng)因素的限制以外，合適的發(fā)酵條件也是不可忽視的重要因素［17］。通過試驗確定菌株1a-3的合適搖瓶發(fā)酵配方和培養(yǎng)條件為:葡萄糖1 g/L、玉米粉3 g/L、大豆粉2 g/L、酵母粉0.3 g/L、KH2PO40.1 g/L、CaCO30.3 g/L、NaCl 0.1 g/L，起始pH值7.0、28℃搖瓶培養(yǎng)60 h，搖瓶裝量30 mL種子培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，轉(zhuǎn)速為200 r/min發(fā)酵后，其效果較好。此試驗在考慮為放大中試及大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵條件打基礎(chǔ)的同時，還要考慮到后續(xù)活性物質(zhì)的分離、提純，因此，除了考慮成本還要看是否會產(chǎn)生過多的色素和離子。并且，發(fā)酵是一個復(fù)雜動態(tài)的生命過程，試驗只對發(fā)酵條件中一些主要影響因子進(jìn)行了分析，為了使其得到充分的產(chǎn)業(yè)化，在后續(xù)的試驗中還將采用生化等方法對其代謝過程進(jìn)行檢測和研究，以明確發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的利用情況與菌絲生長和發(fā)酵液活性之間的關(guān)系［18］，從而有目的地選擇培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。參考文獻(xiàn)

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