朱 麗，霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

朱 麗，霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

建立一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus，MRSA)中mecA和spa基因的檢測(cè)方法。以金葡菌和其他相關(guān)菌種為試驗(yàn)對(duì)象，分別用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ploymerase chain reaction，PCR)和LAMP方法檢測(cè)mecA和spa基因。結(jié)果表明：LAMP法在64℃等溫條件下可在60min內(nèi)成功擴(kuò)增基因，且與傳統(tǒng)PCR方法結(jié)果相同；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可知，LAMP對(duì)mecA和spa基因的檢測(cè)限分別為每菌管102個(gè)和10個(gè)細(xì)胞；肉眼可檢測(cè)到的mecA和spa基因的檢測(cè)限分別為每菌管103個(gè)和10個(gè)細(xì)胞；然后用LAMP法檢測(cè)人工污染原料乳樣本中MRSA，用LAMP法檢測(cè)原料乳中的mecA和spa基因與PCR方法顯示出相同的結(jié)果。LAMP方法可快速檢測(cè)mecA和spa基因，此方法可應(yīng)用于原料乳中MRSA的檢測(cè)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)；mecA基因；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)；肉眼檢測(cè)；spa基因

抗生素的廣泛使用，一方面對(duì)治療細(xì)菌感染起到了至關(guān)重要的作用，另一方面又導(dǎo)致了多種耐藥菌株的出現(xiàn)。由于人們對(duì)抗生素缺乏科學(xué)的認(rèn)識(shí)，盲目使用和依賴(lài)致使細(xì)菌獲得耐藥性的機(jī)率大大增加，因此耐藥菌株的檢出呈逐年上升的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的生命安全[1]。耐藥細(xì)菌所致的感染性疾病己構(gòu)成對(duì)新世紀(jì)抗感染治療的新挑戰(zhàn)。及時(shí)準(zhǔn)確地掌握細(xì)菌耐藥機(jī)制，建立耐藥菌株的快速檢測(cè)方法，對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥和新的抗菌藥物的研制具有重要意義。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SAU)是重要的病原菌，其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus，MRSA)是目前引起感染性疾病的重要致病菌與研究的熱點(diǎn)，目前在臨床上己發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素及對(duì)萬(wàn)古霉素中度敏感的金黃色葡萄球菌出現(xiàn)，由于它的高度耐藥性，己成為醫(yī)院感染的主要致病菌之一[2]。由于金黃色葡萄球菌不會(huì)引起動(dòng)物的死亡或者是立即發(fā)病，所以在動(dòng)物上的重視程度不夠，但隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)乳制品的質(zhì)量也有了更高的要求，近年來(lái)有關(guān)MRSA的研究也逐漸增多[3]。已有研究表明動(dòng)物源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌已經(jīng)在人群中出現(xiàn)[4]，且已證實(shí)我國(guó)牛群中有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染[5]。

mecA基因只存在于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中，且高度保守，根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)不同的引物，用PCR對(duì)菌株中青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillin binding protein 2a，PBP2a)靶DNA特定片段mecA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)展了快速檢測(cè)葡萄球菌中耐甲氧西林菌株的分子診斷技術(shù)。美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(national committee for clinical laboratory standards，NCCLS)指出，一旦金黃色葡萄球菌檢出mecA基因或PBP2a蛋白即可定為MRSA[6]。Song等[7]已獲得了mecA基因的克隆，其序列也已發(fā)布。目前，RT-PCR已廣泛應(yīng)用于檢查mecA基因[8]。一般而言，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，PCR方法可以相對(duì)快速、簡(jiǎn)單的方式完成檢測(cè)，但是PCR方法需要特殊的儀器，如循環(huán)變溫加熱器。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isotherm al amplification，LAMP)方法首先由Notomi等[9]在2000年發(fā)明。LAMP法可在60～65℃等溫的條件下進(jìn)行，且其特異性可歸因于能夠識(shí)別6個(gè)不同序列的四條引物。在等溫的條件下連續(xù)擴(kuò)增可在30～60min內(nèi)產(chǎn)生大量的目標(biāo)DNA，并且此方法可用肉眼通過(guò)在反應(yīng)混合物中加入SYBR greenⅠ顏色的變化判斷DNA的擴(kuò)增[10]。由于本方法僅需要一種類(lèi)型的酶，且不需要特殊的儀器，LAMP將適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)原料乳中金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥性。本研究應(yīng)用LAMP法同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞和實(shí)際樣本中的mecA基因，此外，蛋白A (staphylococcal protein A，spa)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的一個(gè)組成部分，是SAU的種特異基因[11]，還應(yīng)用LAMP檢測(cè)了spa基因。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923甲氧西林敏感)、大腸桿菌(E s c h e r i c h i a c o l i ATCC25922)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853) 黑龍江省應(yīng)用微生物研究所；沙門(mén)氏菌(Salmonella sp CGMCC 1.155 2)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence CGMCC 1.1802)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida CGMCC1.1819) 中國(guó)普通微生物菌株保藏中心；福氏志賀氏菌(Shigella fleχneri 51571-10)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae 51253)、大腸桿菌(Escherichia coli O157∶H7 ATCC 43889)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes HJ-350) 黑龍江省出入境檢驗(yàn)檢疫局；ETEC∶ 44247(615∶16)、EPEC∶44706(111∶58)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes CMCC 54002) 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus，MRSA ATCC43300) 溫州康泰生物有限公司；沙門(mén)氏菌(Salmonella e nterica AT CC13076)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus KLDS71)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus KLDS-8 )、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis KLDS-36)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus th ermophilus KLDS )、雙歧桿菌(Lactobacillus bifidus KLDS) 本實(shí)驗(yàn)室保藏；BstDNA聚合酶(New England Biolab)、DNA markerDL2000 大連寶生物工程有限公司。

SYBR GreenⅠ 日本Takara Bio公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVP凝膠成像儀 美國(guó)UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

MRSA培養(yǎng)于添加苯唑西林的高鹽甘露醇(6mg/mL)的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48h。甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)培養(yǎng)于甘露醇鹽瓊脂；大腸桿菌培養(yǎng)于LB肉湯；沙門(mén)氏菌培養(yǎng)于緩沖蛋白胨水(BPW)；單核增生李斯特菌培養(yǎng)于含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)于普通的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；志賀氏菌培養(yǎng)于GN增菌液；瑞士乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基。

1.2.2 mecA基因表型檢測(cè)

在血瓊脂平板上連續(xù)分純3次得到單個(gè)菌落，根據(jù)NCCLS推薦的頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)，若抑菌圈直徑小于等于19mm，則判斷為MRSA，苯唑西林的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)采用瓊脂稀釋法。

1.2.3 DNA提取

培養(yǎng)菌株使用熱解法進(jìn)行DNA提取，原料乳樣本先采用三氯乙酸法進(jìn)行處理，再用熱裂解法提取DNA。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將獲得的菌株接種于10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，取5mL細(xì)菌菌液置于5mL離心管中，10000r/min離心5min，棄去上清液，加5mL裂解液，100℃水浴10min后，15000r/min離心5min，上清液作為DNA模板，-20℃保存?zhèn)溆肹12-13]。

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)mecA和spa基因

應(yīng)用已有文獻(xiàn)報(bào)道的特異引物及反應(yīng)條件進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增mecA基因和spa基因[6,14]，這些引物的序列如下：mecA正向引物(mA1)：5＇-TGCTATCCACCCTCAAAC AGG-3＇；m e c A反向引物(m A 2)：5＇-A A C G T T G T A ACCACCCCAAGA-3＇；spa正向引物(1095F)：5＇-GACGATC CTTCAGTGAGCAAAG-3＇；spa反向引物(1517R)：5＇-GCAGCAATTTTGTCAGCAGTA-3＇。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 LAMP反應(yīng)

應(yīng)用已有文獻(xiàn)[14]報(bào)道的特異引物及反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增mecA基因和spa基因。每組包括4條引物，一個(gè)正向內(nèi)引物(FIP)、一個(gè)反向內(nèi)引物(BIP)和兩個(gè)外引物(F3和B3)(表1)。

表1 LAMP擴(kuò)增mecA和spa引物Table 1 Primers for LAMP amplification of mecA and spa genes

LAMP反應(yīng)體系共25μL。反應(yīng)混合物包括FIP、BIP各40pmol，F(xiàn)3、B3各5pmol，2μL模板，1μL BstDNA聚合酶(8U)，1.6mmol/L dNTPs，0.8mmol/L betaine，4mmol/L MgSO4，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L (NH4)2SO4，混勻。反應(yīng)在64℃等溫條件下擴(kuò)增60min。保溫完成后將反應(yīng)混合物在80℃反應(yīng)5min結(jié)束反應(yīng)。

1.2.6 LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)

LAMP產(chǎn)物通過(guò)肉眼或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)于肉眼檢測(cè)，在反應(yīng)混合物中加入1μL 10-1稀釋的SYBR GreenⅠ，且顏色變化可在自然光下觀察到。對(duì)于電泳檢測(cè)，2μL反應(yīng)混合物加入到2%的瓊脂糖凝膠電泳。凝膠劑與染色劑溴化乙啶(50μg/mL)混合，在紫外燈(302nm)下進(jìn)行照相。

1.2.7 原料乳樣品的檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法對(duì)采自農(nóng)場(chǎng)的原料乳進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，同時(shí)對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、PCR檢測(cè)，并與這兩種方法進(jìn)行對(duì)比，確定LAMP直接檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌的特異性、靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRSA檢出情況

所購(gòu)買(mǎi)金黃色葡萄球菌經(jīng)頭孢西丁檢測(cè)其抑菌圈直徑平均值為14mm(小于19mm)，為MRSA(圖1a)，質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922直徑平均值為24mm(圖1b)，MSSA直徑平均值為29mm(圖1c)。

圖1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Antimicrobial activity of cefoxitin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and E. coli

2.2 LAMP反應(yīng)的特異性

對(duì)19株培養(yǎng)菌株進(jìn)行LAMP mecA基因和spa基因特異性檢測(cè)。提取DNA樣本(菌液濃度為108CFU/mL)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)LAMP產(chǎn)物。電泳檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖2。LAMP成功地?cái)U(kuò)增出了MRSA中的mecA基因，其他測(cè)試菌株未發(fā)生擴(kuò)增。LAMP反應(yīng)也成功地?cái)U(kuò)增了MRSA和MSSA中的spa基因，同時(shí)用相同的DNA樣本采用常規(guī)PCR方法進(jìn)行mecA和spa基因檢測(cè)。PCR結(jié)果與LAMP結(jié)果一致(圖2和表2)。

圖2 LAMP和PCR方法分別檢測(cè)mecA和spa基因的的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity of LAMP and PCR for mecA and spa gene detection

表2 原料乳及相關(guān)菌株中mecA和spa基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection of mecA and spa genes in MRSA strains and other relevant bacteria

2.3 LAMP和常規(guī)PCR方法的檢測(cè)限

以提取自梯度稀釋的MRSA菌株(ATCC 43300)的DNA為模板，確定LAMP反應(yīng)檢測(cè)限，通過(guò)電泳和肉眼兩種檢測(cè)方法進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。由圖3可知，LAMP檢測(cè)mecA的檢測(cè)限小于102CFU(圖3a)，spa的檢測(cè)限小于10CFU(圖3b)。肉眼檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 LAMP法檢測(cè)mecA和spa基因的檢測(cè)限和傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection limits of LAMP and conventional PCR method for mecA and spa genes

當(dāng)DNA樣本濃度高于103CFU/mL時(shí)，通過(guò)添加SYBR GreenⅠLAMP檢測(cè)mecA反應(yīng)混合物的顏色呈現(xiàn)為綠色，反之，當(dāng)細(xì)胞數(shù)小于102CFU/mL時(shí)，最初的橙黃色未改變(圖4a)。同樣，肉眼檢測(cè)對(duì)于spa的檢測(cè)限也適用于細(xì)胞數(shù)為10CFU/mL的情況(圖4b)。與LAMP方法一樣，采用熱裂解法提取菌體DNA，常規(guī)PCR方法對(duì)于mecA基因和spa基因的檢測(cè)限細(xì)胞數(shù)見(jiàn)圖3，分別為106、106、107CFU。

圖4 肉眼檢測(cè)LAMP擴(kuò)增mecA(a)和spa(b)Fig.4 Naked-eye observation of LAMP amplified mecA (a) and spa (b) genes

2.4 應(yīng)用LAMP法檢測(cè)原料乳樣本中的金黃色葡萄球菌

原料乳樣本的mecA和spa基因采用LAMP方法檢測(cè)。同時(shí)也應(yīng)用傳統(tǒng)方法及常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并將LAMP法與這兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較(表3、4)。收集東北農(nóng)業(yè)大學(xué)原生態(tài)牧場(chǎng)及個(gè)體散戶(hù)原料乳125份，LAMP法檢測(cè)出了82份樣品中含有spa基因(65.6%)，12份原料乳樣本中檢測(cè)出mecA基因(14.6%)。LAMP方法與常規(guī)PCR方法對(duì)原料乳樣本的檢測(cè)結(jié)果100%一致(表3)，國(guó)標(biāo)法共檢測(cè)出85份樣品為陽(yáng)性(68%)，同時(shí)也采用傳統(tǒng)方法——K-B藥敏試驗(yàn)法對(duì)MRSA進(jìn)行檢測(cè)，其與LAMP檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表4、5。

表3 原料乳樣本mecA、spa基因檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection of mecA and spa in raw milk samples

表4 L AMP法檢測(cè)原料乳中MSSA、MRSA的實(shí)用性評(píng)價(jià)Table 4 Practical evaluation of LAMP for quantitative determination of Staphylococcus aureus in raw milk

表5 LAMP法與K-B法藥敏試驗(yàn)檢出個(gè)數(shù)比較Table 5 Comparison of mecA gene positive detection rate of LAMP and K-B methods

由表5可知，LAMP法與K-B藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，LAMP陽(yáng)性一致率為91.67%。

3 討 論

由于牧場(chǎng)使用抗生素的量日益增加，所以必須對(duì)MRSA菌株抗生素耐藥性加以重視。PCR方法是一種快速檢測(cè)微生物的分子技術(shù)，然而，往往由于缺乏設(shè)備，尤其對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)來(lái)說(shuō)，該方法常常很難實(shí)施。因此，對(duì)于乳品安全來(lái)說(shuō)發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)單的檢測(cè)抗生素耐藥性的方法十分必要。mecA是MRSA耐藥決定基因，91.7%的MRSA含mecA[3]。在本研究中，應(yīng)用LAMP方法進(jìn)行mecA和spa基因檢測(cè)。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要24～48h，PCR方法需要2～4h的反應(yīng)時(shí)間，LAMP反應(yīng)可在60min內(nèi)完成。與這些方法相比，應(yīng)用LAMP方法檢測(cè)mecA和spa基因具有明顯的優(yōu)勢(shì)——快速。然而，以PCR方法為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的Rt-PCR也擁有快速的優(yōu)勢(shì)。盡管需要昂貴的儀器，但是通過(guò)加入SYBR Green化學(xué)物，完成該反應(yīng)與LAMP方法所需要的花費(fèi)相似[15]。檢驗(yàn)員需要根據(jù)檢測(cè)的目的和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境選擇合適的方法。

LAMP方法由于其特殊設(shè)計(jì)的2條內(nèi)引物和兩條外引物以識(shí)別6個(gè)不同區(qū)域的序列而具有明顯的特異性。使用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，LAMP方法檢測(cè)mecA和spa基因和預(yù)期的一樣具有高度特異性。LAMP方法與傳統(tǒng)的PCR方法結(jié)果完全一致。

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，LAMP檢測(cè)mecA和spa基因的檢測(cè)限分別為小于103、10CFU，然而，為了適宜于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)對(duì)DNA快速、簡(jiǎn)便提取的需求，對(duì)于PCR方法也應(yīng)用熱裂解提取的菌體DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果其檢測(cè)mecA和spa基因的檢測(cè)限分別為小于106、107CFU，這充分說(shuō)明LAMP方法在DNA模板純化方面的優(yōu)越性。但是，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)原料乳樣本的實(shí)際檢測(cè)時(shí)采用試劑盒提取的菌體DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，此時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果與LAMP結(jié)果相同。因此，LAMP方法與PCR方法相比其靈敏性基本相當(dāng)或高于PCR方法。并且LAMP反應(yīng)可通過(guò)加入環(huán)引物加快反應(yīng)的進(jìn)行，并提高靈敏度。

肉眼檢測(cè)LAMP擴(kuò)增spa基因的產(chǎn)物與電泳檢測(cè)結(jié)果具有相同的靈敏度(每管細(xì)胞數(shù)為10 CF U)，然而LAMP對(duì)mecA基因檢測(cè)的靈敏度下降到103CFU。通過(guò)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，肉眼檢測(cè)mecA基因的擴(kuò)增結(jié)果的靈敏度可提高到102CFU。對(duì)于LAMP方法來(lái)說(shuō)相當(dāng)簡(jiǎn)單、快速的肉眼檢測(cè)辦法將會(huì)很有應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)于實(shí)際原料乳樣本的檢測(cè)，LAMP方法和PCR方法結(jié)果相同，這表明實(shí)際應(yīng)用該方法檢測(cè)原料乳樣本的可能性。本研究中DNA的提取是采用簡(jiǎn)單的煮沸法。原料乳樣本的分析對(duì)于揭示抗生素耐藥性的攜帶與乳房炎的關(guān)系具有重要的檢測(cè)意義。

用本研究所建立的檢測(cè)方法對(duì)所收集的125份樣品進(jìn)行檢測(cè)，新建方法的陽(yáng)性檢出率為91.67%。其中兩株mecA為陽(yáng)性，而耐藥性為陰性，這種現(xiàn)象說(shuō)明mecA表達(dá)PBP2a所致耐藥性，還受到其他基因的調(diào)控。另有一株常規(guī)藥敏試驗(yàn)鑒定為MRSA，而LAMP基因檢測(cè)mecA為陰性，隨后用培養(yǎng)的菌落進(jìn)行同樣的基因檢測(cè)，結(jié)果mecA為陽(yáng)性，說(shuō)明熱裂解法提取金黃色葡萄球菌DNA時(shí)，可能對(duì)樣品中細(xì)菌量少的細(xì)菌可能落檢[16]。

LAMP反應(yīng)檢測(cè)mecA和spa基因均在1h內(nèi)完成，且具有高度的特異性和靈敏性。此外，由于可通過(guò)肉眼進(jìn)行檢測(cè)，LAMP方法具有明顯的簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)勢(shì)。本研究所建立的LAMP檢測(cè)方法很有潛力成為檢測(cè)mecA和spa基因的有力工具。

[1]李靜媚, 凌玲, 楊坤祥. 食品中金黃色葡萄球菌的耐藥性分析[J]. 職業(yè)與健康, 2009, 25(3)∶ 255-256.

[2]HIRAMATSU K, HANAKI H, INO T, et a1. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical train with reduced vancomycin susceptibility[J]. J Antimicrob Chemother, 1997, 40(1)∶ 135-136.

[3]劉君, 陳創(chuàng)夫, 褚明亮. 牛源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分離鑒定[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29(9)∶ 42-44.

[4]鄧艷琴. 美國(guó)《Emerging Infectious Diseases》2007年第12期有關(guān)人獸共患病論文摘譯[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2008, 24(2)∶ 90.

[5]譚磊. 基于PCR的牛源金黃色葡萄球菌基因分型研究[D]. 大慶∶ 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 2008.

[6]胡繼紅, 高振翔, 尹銘芳. 美國(guó)NCCLS 2002年版抗生素藥敏試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)更新內(nèi)容[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 25(6)∶ 367.

[7]SONG M D, WACHI M, DOI M, et a1. Evolution of an inducible penicillin-target protein in methicillin-resistant Staphylococcus aureus by gene fusion[J]. FEBS Lett, 1987, 221(1)∶ 167-171.

[8]MAKGOTLHO P E, KOCK M M, HOOSEN A, et al. Molecular identification and genotyping of MRSA isolates[J]. FEMS Immunol Med Microbio, 2009, 57(2)∶ 104-115.

[9]NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCH H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(13)∶63.

[10]IWAMOTO T, SONOBE T , HAYASHI K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum samples[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6)∶ 2616-2622.

[11]HALLIN M, FRIEDRICH A W , STRUELENS M J. Spa typing for epidemiological surveillance of Staphylococcus aureus[J]. Methods Mol Biol, 2009, 551∶ 189-202.

[12]ENOSAWA M, KAGEYAMA S, SAWAI K, et al. Use of loop-mediated isothermal amplification of the IS900 sequence for rapid detection of cultured Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(9)∶ 4359-4365.

[13]AKEMI Y, RIKA I, RIE H. Rapid and sensitive detection of heat-labileⅠand heat-stableⅠenterotoxin genes of enterotoxigenic Escherichia coli by loop-mediated isothermal amplification[J]. J Microbiological Methods, 2007, 68(2)∶ 414-420.

[14]SHOPSIN B, GOMEZ M, MONTGOMERY S O, et al. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(11)∶ 3556-3563.

[15]KOIDE1 Y, MAEDA1 H, YAMABE1 K, et al. Rapid detection of mecA and spa by the loop mediated isothermal amplification (LAMP) method [J]. J Letters in Applied Microbiology, 2010, 50(4)∶ 386-392.

[16]SILVERMAN G J, GOODYEAR C S, SIEGEL D L. On the mechanism of staphylococcal protein A immunomodulation[J]. Transfusion, 2005, 45(2)∶ 274-280.

Rapid Detection of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Loop-mediated Isothermal Amplification

ZHU Li，HUO Gui-cheng*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

A rapid assay was developed for the detection of mecA and spa gene present in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Staphylococcus aureus and other relevant bacteria were detected for their mecA and spa genes by both polymerase chain reaction (PCR) and LAMP methods. Gene amplification was successfully achieved by LAMP within 60 min when the temperature was held at 64 ℃, and the results were consistent results with those of the conventional PCR methods. The limits of detection of the LAMP method for mecA and spa genes were identified by agarose gel electrophoresis to be 102and 10 cells per tube and observed by naked eyes to be 103and 10 cells per tube respectively. The LAMP method was then applied to artificially polluted raw milk, and gave identical results with the traditional PCR methods. LAMP can rapidly detect mecA and spa genes, thus providing an applicable assay for detecting MRSA in raw milk.

loop-mediated isothermal amplification (LAMP)；mecA gene；methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)；naked-eye observation；spa gene

TS207.4

A

1002-6630(2011)16-0213-06

2010-10-17

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BD04A08)

朱麗(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：thpzhuli@163.com

*通信作者：霍貴成(1958—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：gchuo58@126.com