王 英，張玉剛，戴洪義*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，山東 青島 266109)

蘋果果皮中類黃酮的超聲波輔助提取及穩(wěn)定性研究

王 英，張玉剛，戴洪義*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，山東 青島 266109)

應(yīng)用超聲波法提取蘋果果皮中的類黃酮，得到類黃酮提取的最佳工藝條件，并對產(chǎn)品穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：蘋果果皮中類黃酮的最佳提取條件為溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間20min、料液比1∶25 (g/mL)，此條件下提取率為27.56mg/g，超聲波法提取蘋果果皮中類黃酮重現(xiàn)性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.55%；提取的類黃酮在pH6.0左右較穩(wěn)定，溫度超過40℃時穩(wěn)定性較差，光照會使類黃酮穩(wěn)定性降低；H2O2、Na2SO3和NaNO2使類黃酮吸光度明顯下降，VC對類黃酮吸光度下降不明顯。Mg2＋、Ca2＋使類黃酮提取液吸光度增大，Pb2＋、Cu2＋、Fe3＋使其吸光度降低，Zn2＋、Al3＋、K＋對其吸光度影響不大。蘋果果皮類黃酮不耐高溫、不耐酸堿，VC、Zn2＋、Al3＋、K＋對其穩(wěn)定性的影響不明顯，H2O2、Na2SO3、NaNO2、Mg2＋、Ca2＋、Pb2＋、Cu2＋、Fe3＋對其穩(wěn)定性影響明顯。

蘋果果皮；類黃酮；超聲波提??；穩(wěn)定性

類黃酮是廣泛存在水果和蔬菜中的一類次生代謝物質(zhì)，具有很強的清除自由基[1]、抗衰老、增加機體免疫力的作用[2-3]，因此，類黃酮已經(jīng)成為近年來研究的熱點[4]。蘋果果實中含有豐富的類黃酮物質(zhì)，而果皮中類黃酮種類及含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于果肉部分[5-6]，Tsao等[7]對8個蘋果品種進(jìn)行了測定，果皮中含834.2～2300.3mg/kg，果肉中含15～605.6mg/kg。隨著人們對食品安全認(rèn)識的提高，往往由于懼怕果皮中農(nóng)藥殘留而將其棄去，造成了營養(yǎng)物質(zhì)的極大浪費，充分利用果皮不但可以提高蘋果資源的利用率，還可以為蘋果加工產(chǎn)業(yè)提供新的出路。

超聲波輔助提取是一種利用外力強化提取的新技術(shù)[8]，有助于溶質(zhì)擴散，可以明顯地加速植物體和種子中有機成分的提取過程，在天然產(chǎn)物提取中顯出明顯優(yōu)勢[9-10]。本實驗擬采用超聲波法提取蘋果果皮中的類黃酮，以乙醇為提取劑，確定類黃酮提取的最佳工藝，并分析光照、溫度、p H值、氧化劑、還原劑及金屬離子對蘋果類黃酮提取液穩(wěn)定性的影響，以期為對蘋果果皮綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的蘋果雜種品系95-32(特拉蒙×嘎啦)的果實。

乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、H2O2、KCl、AlCl3、CaCl2、FeCl3、Pb(CH3COO)2、HCl、NaOH (上述試劑均為分析純)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞95%) 上海同田生化技術(shù)有限公司。

FD-1-50型冷凍干燥機 上海比朗儀器有限公司；HR2006型攪拌機 荷蘭飛利浦公司；KQ-300型數(shù)控超聲波清洗器(超聲功率210W，40Hz) 昆山市超聲儀器有限公司；SBH-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Ultrospec 3300 pro型紫外-可見光分光光度計 美國安瑪西亞公司。

1.2 方法

1.2.1 類黃酮含量測定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法[11]測定類黃酮含量，在500nm波長處測吸光度。

1.2.2 蘋果果皮中類黃酮的超聲波輔助提取方法及提取率計算

稱取適量的凍干粉碎的蘋果果皮于具塞三角瓶中，按一定的料液比和質(zhì)量濃度加入溶劑，在一定溫度下超聲提取一定時間，過濾，定容，按1.2.1節(jié)方法測定其吸光度。

式中：提取率以1g蘋果果皮粉提取總黃酮的毫克數(shù)表示，單位為mg/g；C為質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為濾液定容體積/mL；m為所用蘋果果皮粉的質(zhì)量/g。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

選擇乙醇溶液作為蘋果果皮的有機溶劑提取液。通過單因素試驗測定，采用L9(34)正交試驗組合表，對提取溫度(50、60、70℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25)和提取時間(20、30、40min)各因素進(jìn)行正交試驗，研究各因素對蘋果果皮類黃酮提取率的影響。

1.2.4 類黃酮的穩(wěn)定性測定

采用1.2.1節(jié)方法測定不同pH值、溫度、光照、N a C l、蔗糖、金屬離子、氧化劑、還原劑條件下蘋果類黃酮吸光度變化，觀察測定各因素對類黃酮化合物的穩(wěn)定性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果果皮中類黃酮超聲波輔助提取最佳條件的確定

表1 蘋果果皮中類黃酮超聲波輔助提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design for optimizing ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from apple peel and corresponding experimental results

正交試驗的極差分析結(jié)果(表1)表明：4因素對蘋果黃酮提取量的影響程度從高到低依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞超聲提取時間，結(jié)合k值可以確定最佳提取工藝條件應(yīng)為A2B2C1D3，即提取溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25(g/mL)、超聲提取時間20min。

按正交試驗結(jié)果確定的最佳工藝，重復(fù)提取蘋果果皮3次，經(jīng)提取計算和含量測定結(jié)果表明該工藝重現(xiàn)性好，達(dá)到了優(yōu)化的目的，結(jié)果為類黃酮平均提取率27.56mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.55%。

2.2 不同因素對蘋果果皮中類黃酮穩(wěn)定性的影響

2.2.1 溫度對蘋果果皮類黃酮穩(wěn)定性的影響

將提取液分別在20、40、60、80℃條件下保溫，分別于1、2、7h后取出，冷卻后觀察溶液顏色的變化并測定吸光度。由圖1可知，在40℃以下蘋果皮中類黃酮類化合物比較穩(wěn)定，40℃以上吸光度明顯增大，且顏色逐漸加深。當(dāng)超過60℃時隨著時間的延長其吸光度變化較大，7h后其吸光度增大較快，說明在較高溫度下類黃酮穩(wěn)定性較差[12]。因此，由實驗結(jié)果可知，蘋果皮中黃酮類化合物耐熱性較差，應(yīng)在40℃以下使用。

圖1 溫度對類黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on the stability of apple peel flavonoids

2.2.2 酸、堿對蘋果果皮中類黃酮的穩(wěn)定性影響

用HCl、NaOH調(diào)節(jié)黃酮提取液的pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室溫放置12h在波長500nm處測定類黃酮提取液的吸光度。

圖2 不同酸堿度對類黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH value on the stability of apple peel flavonoids

由圖2可知，提取液pH6.0時吸光度最大，與原樣液吸光度接近。顏色變化：pH值減小時黃色逐漸變淺；pH值增大時黃色逐漸加深且吸光度變小。說明蘋果果皮中黃酮類化合物在酸堿性較強的環(huán)境中容易受到破壞，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。

2.2.3 H2O2對蘋果果皮中黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

向提取液中加入H2O2，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別0.005%、0.01%、0.05%、0.1%，室溫放置1h和6h后測定溶液吸光度。由圖3可知，蘋果果皮中黃酮類化合物的吸光度隨H2O2濃度的增加而逐漸減小，6h后所測的吸光度下降的幅度比1h后所測值大，說明放置時間越長類黃酮化合物對氧化劑的穩(wěn)定性越差。強氧化劑H2O2可以使類黃酮結(jié)構(gòu)中的雜環(huán)開裂，起到氧化降解作用[13]。因此，在蘋果果皮提取液儲存和使用時應(yīng)注意避免其與氧化劑接觸。

圖3 H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對類黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of H2O2on the stability of apple peel flavonoids

2.2.4 光對蘋果果皮中黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

將提取液于室溫條件下分別放置于黑暗處、自然光與太陽光下，測定不同光照對蘋果類黃酮穩(wěn)定性的影響。由圖4可知，在不同的光照條件下類黃酮的穩(wěn)定性有一定的差異：在避光、自然光及太陽光下放置5d后，類黃酮提取液的吸光度分別下降7.8%、13.7%、22.3%；在自然光和太陽光下不穩(wěn)定，這是由于類黃酮物質(zhì)發(fā)生了自身氧化聚合，使其部分降解；隨著時間延長，顏色由亮黃色變?yōu)橥咙S色；在陽光下長時間放置，類黃酮提取液中有沉淀出現(xiàn)；在避光保存下，提取液吸光度變化不大，所以蘋果果皮類黃酮提取液應(yīng)避光保存。

圖4 光對類黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of light on the stability of apple peel flavonoids

2.2.5 金屬離子對蘋果皮中黃酮類化合物的穩(wěn)定性的影響

向提取液中分別加入AlCl3、CuCl2、MgCl2、ZnCl2、KCl、CaCl2、Pb(C2H3O2)2，使其濃度梯度均為0.01、0.05、0.10、0.20mol/L以及FeCl3濃度梯度為0.0005、0.001、0.005、0.01mol/L，室溫放置6h后測定測定蘋果皮中類黃酮提取液的吸光度。由表2可知，各種金屬離子對類黃酮吸光度均有一定影響，放置6h后，類黃酮提取液在濃度為0.01mol/L Mg2+、Ca2+影響下吸光度分別升高37.9%，41.9%，在濃度為0.01mol/L的Zn2+、Al3+、K+、Pb2+、Cu2+影響下吸光度分別降低6.0%、6.4%、3.8%、23.0%、37.4%，而濃度為0.01mol/L Fe3+吸光度降低55.2%，說明Mg2+、Ca2+、Pb2+、Cu2+、Fe3+對類黃酮穩(wěn)定性影響較大。原因可能是由于黃酮類化合物的鄰二酚羥基與金屬離子絡(luò)合而引起的[14-15]。因此，在類黃酮提取液儲存過程中應(yīng)避免與鐵、銅、鋁、鉛、鎂的容器接觸。

表2 金屬離子對類黃酮穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of metal ions on the stability of apple peel flavonoids

表3 不同濃度的Fe3+對類黃酮穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of different concentrations of Fe3+on the stability of apple peel flavonoids

2.2.6 NaNO2、VC、Na2SO3對蘋果果皮類黃酮提取液的影響

圖5 不同還原劑對蘋果類黃酮的影響Fig.5 Effect of reducing agents on the stability of apple peel flavonoids

向提取液中分別添加2%的NaNO2、VC、Na2SO3，分別放置0、1、2、3、4d測定其吸光度。由圖5可知，還原劑Na2SO3和NaNO2對類黃酮穩(wěn)定性影響較大，常溫放置4d后添加2%的Na2SO3、NaNO2、VC及原液的類黃酮提取液吸光度分別下降47.7%、34.0%、10.9%和1.6%。亞硫酸鹽和亞硝酸鹽較類黃酮類物質(zhì)更易氧化。加入VC的提取液顏色變淺，吸光度降低，原因在于抗壞血酸引起了提取液中類黃酮的降解[16]。VC對類黃酮具有雙重作用，當(dāng)含量較少時有促進(jìn)類黃酮穩(wěn)定的作用，當(dāng)VC含量高時會對類黃酮穩(wěn)定性有負(fù)面效應(yīng)[17]，所以在食品應(yīng)用中應(yīng)合理應(yīng)用。

3 結(jié) 論

3.1 蘋果果皮類黃酮超聲波輔助提取的最佳條件為提取溫度60℃、提取時間20min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶25(g/mL)，此條件下提取率可達(dá)27.56mg/g。各因素影響順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時間。

3.2 蘋果果皮類黃酮在pH6.0左右比較穩(wěn)定，在強酸和強堿條件中穩(wěn)定性較差。氧化劑H2O2和還原劑NaNO2、Na2SO3對類黃酮穩(wěn)定性影響較大，VC對其穩(wěn)定性影響較小。高溫加熱對黃酮穩(wěn)定性有一定影響，應(yīng)盡量在低溫下貯存。類黃酮提取液對光穩(wěn)定性較差，長時間貯存應(yīng)避光保存。類黃酮對葡萄糖，N a C l較穩(wěn)定。Al3+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mg2+對其影響較大，Zn2+、K+、Ca2+對其影響較小。在生產(chǎn)和貯存使用過程中應(yīng)避免與類黃酮穩(wěn)定性有關(guān)的不利因素，以保持類黃酮化合物的穩(wěn)定性。

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Ultrasonic-assisted Extraction and Stability of Flavonoids from Apple Peel

WANG Ying，ZHANG Yu-gang，DAI Hong-yi*
(College of Landscaping and Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

In this study, orthogonal array design was employed to optimize the conditions for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from apple peel. Along with this, the stability of flavonoids extracted from apple peel was evaluated. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 60 ℃, ethanol concentration of 60%, extraction duration of 20 min, and material-to-liquid ratio of 1∶25. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of flavonoids was 27.56 mg/g. Meanwhile, the extracted flavonoids were stable at pH 6.0 and unstable at a temperature over 40 ℃. Light illumination could result in a decrease of stability. In addition, H2O2, Na2SO3, NaNO2, Pb2+, Cu2+, and Fe3+could obviously reduce the absorbance of flavonoids; on the other hand, Mg2+and Ca2+could result in an increase in the absorbance of apple peel flavonoids. Vitamin C, Zn2+, Al3+, and K+did not reveal obvious effect on the absorbance of apple peel flavonoids. Therefore, ultrasonic-assisted extraction reveals high efficiency and reproducibility with RSD of 0.55% in extracting apple peel flavonoids. Flavonoids from apple peel have weak tolerance to high temperature as well as strong acid and alkali. Although VC, Zn2+, Al3+, and K+exhibit less effect on the stability of apple peel flavonoids, H2O2, Na2SO3, NaNO2, Mg2+, Ca2+, Pb2+, Cu2+and Fe3+have obvious impact on the stability of apple peel flavonoids.

apple peel；flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；stability

TS202.1

A

1002-6630(2011)16-0178-04

2010-11-09

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蘋果)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-28-01-07)；山東良種產(chǎn)業(yè)化工程項目

王英(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為果樹育種與生物技術(shù)。E-mail：ying841063@163.com

*通信作者：戴洪義(1956—)，男，教授，碩士，研究方向為果樹育種。E-mail：hydai@qau.edu.cn