王 倩，賈長虹*，常麗新，唐紅梅

(河北聯(lián)合大學生命科學學院，河北 唐山 063009)

雙水相萃取法分離純化狗棗獼猴桃葉總黃酮

王 倩，賈長虹*，常麗新，唐紅梅

(河北聯(lián)合大學生命科學學院，河北 唐山 063009)

采用聚乙二醇-硫酸鈉雙水相體系分離純化狗棗獼猴桃葉黃酮，確定其雙水相體系組成24% PEG400-15% Na2SO4，并通過單因素試驗和正交試驗探討黃酮粗提液質(zhì)量濃度、KCl添加量、pH值和溫度對萃取效果的影響。結果表明：黃酮粗提液質(zhì)量濃度和pH值對黃酮萃取效果影響最大，其次為KCl添加量，溫度的影響較?。蛔罴演腿l件為粗提液質(zhì)量濃度C0、KCl添加量2%、pH9、25℃。在此條件下，狗棗獼猴桃葉黃酮主要分布在上相，分配系數(shù)為24.31，萃取率達到96.90%。此方法操作簡單方便、成本低，是黃酮類化合物分離純化的一種有效方法。

雙水相體系；分離純化；狗棗獼猴桃葉；黃酮

狗棗獼猴桃是一種野生的獼猴桃科植物，別名深山木天寥、狗棗子，屬多年生落葉藤本植物，主要分布于我國東北、華北、華中、西北、西南部以及朝鮮、日本、俄羅斯等國。其葉中含有多種化學成分，主要有生物堿、咖啡酸、香豆素、黃酮類物質(zhì)等[1]，因此可入藥，具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值。尤其黃酮類化合物含量豐富，具有抗氧化、抗腫瘤、抗過敏、延緩衰老及降血糖、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[2]。

雙水相萃取技術是一種高效而溫和的分離技術，操作簡便，且容易放大，能夠保持生物活性，因此被廣泛應用于生物產(chǎn)品的分離和純化[3-5]。近年來，雙水相萃取技術在黃酮類化合物的分離純化中得到了應用[6]，本實驗采用聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系分離純化狗棗獼猴桃葉黃酮，以期為植物中黃酮的分離純化與開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狗棗獼猴桃葉：2009年9月底采自河北省霧靈山區(qū)。將采集的狗棗獼猴桃葉先用自來水洗凈，再用蒸餾水洗3遍，用濾紙或紗布吸干表面水，于90℃滅酶15min，在60～65℃烘干至脆。將烘干的狗棗獼猴桃葉粉碎，過篩，備用。

聚乙二醇(PEG400、600、1000、2000、4000)、硫酸鈉、無水乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；JA2003電子天平 上海上平儀器公司；MVS-1型旋渦混合器 北京金北德工貿(mào)有限公司；KQ-100B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；800-離心機 江蘇金壇城西小陽電子儀器廠；PHS-3C型酸度計 上海理達儀器廠；752型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 金壇市精達儀器制造廠；202-0臺式電熱干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 狗棗獼猴桃葉黃酮提取液的制備

先將過100目篩的狗棗獼猴桃葉粉末用石油醚于索氏提取器中抽提7h脫去其中的脂肪。烘干，準確稱取一定量脫脂后的狗棗獼猴桃葉粉末，按料液比1∶40(g/ mL)加入體積分數(shù)45%乙醇溶液，室溫浸泡1h，50℃超聲處理25min，再于室溫浸泡1h，50℃超聲處理25min，連續(xù)提取2次，過濾，合并濾液，經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀濃縮，而后用醇沉法(95%乙醇溶液)除去糖類、蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)。于40℃減壓濃縮，濃縮液質(zhì)量濃度C0為3.4284mg/mL，將濃縮液用去離子水調(diào)配成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，備用。

1.3.2 PEG-Na2SO4雙水相體系的配制

稱取一定量的PEG、氧化鈉、蒸餾水和一定體積的黃酮粗提液于小燒杯中，使雙水相總質(zhì)量為10g，磁力攪拌至兩相充分混勻并調(diào)節(jié)pH值，2000r/min離心5min，以加速相分離過程。準確測定上、下相體積，用膠頭滴管分別吸取上、下相溶液進行分析，測定上下相中狗棗獼猴桃葉黃酮的含量[用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定][7]。

式中：Vu為上相體積/mL；Vd為下相體積/mL；Cu為上相黃酮的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；Cd為下相黃酮的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.3.3 PEG-Na2SO4雙水相體系的確定

以PEG平均相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分數(shù)、Na2SO4質(zhì)量分數(shù)3項確定雙水相體系[8-9]。

1.3.4 影響狗棗獼猴桃葉黃酮萃取的因素

1.3.4.1 單因素試驗設計

在確定了雙水相體系組成后，探討黃酮粗提液質(zhì)量濃度、KCl添加量、pH值、溫度對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取效果的影響[10]。

1.3.4.2 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，設計黃酮粗提液質(zhì)量濃度、KCl添加量、pH值、溫度4因素3水平正交試驗，確定雙水相體系萃取狗棗獼猴桃葉黃酮的最佳工藝。

2 結果與分析

2.1 PEG平均相對分子質(zhì)量對雙水相體系的影響

選擇24% PEG(相對分子質(zhì)量為400、600、1000、2000、4000)，20% Na2SO4和3mL質(zhì)量濃度為C0/4的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液組成雙水相體系，在室溫(25℃)條件下，磁力攪拌至兩相充分混勻并調(diào)節(jié)pH7，再于2000r/min離心5min，而后對上、下相溶液進行分析。

圖1 PEG平均相對分子質(zhì)量對雙水相體系的影響Fig.1 Effect of PEG molecular weight on partition coefficient and extraction efficiency

由圖1可知，Na2SO4對不同相對分子質(zhì)量的PEG均具有良好的分相能力，分配系數(shù)和萃取率隨PEG相對分子質(zhì)量的增大而降低。這是由于隨著PEG相對分子質(zhì)量的降低，分子內(nèi)極性基團(如羥基等)的比例相對較高，親水性程度增強，從而導致體系黏度減小[11]。在PEG400時分配系數(shù)和萃取率最大，說明狗棗獼猴桃葉黃酮親水性較強，因此選擇PEG400。

2.2 PEG質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響

選取9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30% PEG400，21% Na2SO4和3mL質(zhì)量濃度為C0/4的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液組成雙水相體系，在室溫(25℃)條件下，磁力攪拌至兩相充分混勻并調(diào)pH7，2000r/min離心5min，對上下相溶液進行分析。

由圖2可知，PEG400質(zhì)量分數(shù)過低時，接近臨界點，不易形成雙水相體系；隨著PEG400質(zhì)量分數(shù)的增大，體系逐漸遠離臨界點，而使兩相差別增大，易于形成雙水相。分配系數(shù)和萃取率隨PEG400質(zhì)量分數(shù)的增加而增大，但PEG400質(zhì)量分數(shù)過大時，體系黏度增大，阻止相間分子轉移的能力增加，影響傳質(zhì)，導致分配系數(shù)下降，從而影響萃取率。因此，選擇PEG400的最佳質(zhì)量分數(shù)為24%。

圖2 PEG400質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響Fig. 2 Effect of PEG400 concentration on partition coefficient and extraction efficiency

2.3 Na2SO4質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響

分別選取9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30% Na2SO4，24% PEG400和3mL質(zhì)量濃度為C0/4的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液分別組成雙水相體系，在室溫(25℃)條件下，磁力攪拌至兩相充分混勻并調(diào)pH7，2000r/min離心5min，對上下相溶液進行分析。

圖3 Na2SO4質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響Fig.3 Effect of Na2SO4 concentration on partition coefficient and extraction efficiency

由圖3可知，隨著Na2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，分配系數(shù)和萃取率先是逐漸上升，當質(zhì)量分數(shù)達到15%時呈下降趨勢?？梢?，Na2SO4質(zhì)量分數(shù)影響雙水相體系，可以改變各相中成相物質(zhì)的組成和相比，從而影響黃酮在上相中的分配，導致分配系數(shù)和萃取率隨Na2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加而下降。因此Na2SO4的最佳質(zhì)量分數(shù)選擇15%。

2.4 單因素試驗

2.4.1 粗提液質(zhì)量濃度對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取效果的影響

將24% PEG400-15% Na2SO4和3mL質(zhì)量濃度分別為C0、C0/2、C0/4、C0/6、C0/8的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液組成雙水相體系，調(diào)節(jié)pH7，在室溫(25℃)下，磁力攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，對上下相溶液進行分析。

圖4 粗提液質(zhì)量濃度對雙水相體系的影響Fig.4 Effect of crude extract concentration on partition coefficient and extraction efficiency

由圖4可知，分配系數(shù)和萃取率隨粗提液質(zhì)量濃度的降低而降低。可見，粗提液的質(zhì)量濃度影響上下相的分配，當質(zhì)量濃度為C0時萃取率最大。因此，確定粗提液質(zhì)量濃度最佳為C0。

2.4.2 KCl質(zhì)量分數(shù)對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取效果的影響

將24% PEG400-15% Na2SO4、3mL質(zhì)量濃度為C0的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液作為雙水相體系，在pH7、室溫(25℃)條件下，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0% KCl，磁力攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，對上下相溶液進行分析。

圖5 KCl質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響Fig.5 Effect of KCl concentration on partition coefficient and extraction efficiency

由圖5可知，隨著KCl質(zhì)量分數(shù)增加，分配系數(shù)變化基本與萃取率的變化同步。無機鹽的加入可以改變兩相間的電位差和相比，縮短了分相時間，提高了相分離速度，從而增加了黃酮在上相的分配，但鹽質(zhì)量分數(shù)增加到一定程度后，萃取相的極性增強，使黃酮的溶解度下降導致出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，使分配系數(shù)降低[12]。由實驗結果可知，KCl添加量為2%時，萃取率最高。因此，KCl最佳質(zhì)量分數(shù)選擇2%左右為宜。

2.4.3 pH值對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取效果的影響

將24% PEG400、15% Na2SO4和3mL質(zhì)量濃度為C0的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液組成雙水相體系，添加2%的KCl，在室溫(25℃)條件下，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)體系pH值，在pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0條件下，磁力攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，對上下相溶液進行分析。

圖6 pH值對雙水相體系的影響Fig.6 Effect of pH value on partition coefficient and extraction efficiency

由圖6可知，pH＜9時，隨著pH值增大分配系數(shù)和萃取率逐漸增大；pH9時分配系數(shù)和萃取率達最大；當pH＞9時，分配系數(shù)和萃取率隨pH值的增大而減小。這是因為pH值改變了黃酮的電荷性質(zhì)，也改變了無機離子的分配情況，從而影響兩相之間的電位差。在PEG-Na2SO4雙水相體系中，上相電位為正，下相電位為負，當pH＞7時，狗棗獼猴桃葉黃酮帶負電，隨著pH值的升高，體系的相間電位差增加，使黃酮分配到電位為正的上相，則分配系數(shù)隨之上升。但堿性過強時，會破壞黃酮母核，導致黃酮的萃取率降低。當pH＜7時，黃酮的電離平衡受到影響，并吸附H+而攜帶正電荷，隨pH值的降低，黃酮開始向電位為負的下相富集，分配系數(shù)下降[13]，因此選擇pH9。

2.4.4 溫度對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取效果的影響

將24% PEG400、15% Na2SO4和3mL質(zhì)量濃度為C0的狗棗獼猴桃葉黃酮粗提液作為雙水相體系，添加2% KCl，在pH9時，分別在溫度25、30、35、40、45、5 0、5 5、6 0℃條件下，磁力攪拌至兩相充分混勻，2000r/min離心5min，對上下相溶液進行分析。

圖7 溫度對雙水相體系的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on partition coefficient and extraction efficiency

由圖7可知，萃取率和分配系數(shù)均隨溫度的升高而降低。升溫后會加快相分離的速度，有利于雙水相的形成，但溫度的升高也會增大溶質(zhì)的擴散作用，從而影響分配系數(shù)，導致黃酮萃取率逐漸降低[14]，因而選擇25℃。

2.5 狗棗獼猴桃葉黃酮提取工藝正交試驗

表1 萃取工藝確定L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表2 萃取工藝確定正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

從表2可以看出，粗提液質(zhì)量濃度、KCl添加量、pH值、溫度對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取率均具有一定的影響，影響因素大小順序為A＞C＞B＞D，即影響萃取率的主要因素是粗提液質(zhì)量濃度和pH值，其次為K C l添加量，溫度的影響較小。最佳萃取條件為A1B2C3D1，即pH9、溫度25℃、KCl添加量2%、粗提液質(zhì)量濃度為C0(即3.4284mg/mL)。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of extraction efficiency of total flavonoids with various process conditions

由表3方差分析可以看出，粗提液質(zhì)量濃度和pH值的P值均小于0.01，KCl添加量的P值小于0.05，溫度的P值大于0.05。表明粗提液質(zhì)量濃度和pH值對狗棗獼猴桃葉黃酮萃取率的影響極顯著，KCl添加量影響顯著，而溫度影響不顯著，通過F值的大小驗證了正交試驗極差分析的A＞C＞B＞D結論，即影響狗棗獼猴桃葉黃酮萃取率的因素順序為粗提液質(zhì)量濃度＞pH值＞KCl添加量＞溫度。

2.6 最佳工藝條件驗證

根據(jù)所確定的最佳操作條件，在24% PEG400、15% Na2SO4、2% KCl、pH9、25℃條件下，以3mL質(zhì)量濃度為C0的粗提液進行5次平行實驗。最佳工藝條件驗證結果為分配系數(shù)K＝24.31、萃取率96.90%。由驗證實驗結果可知，實驗重現(xiàn)性較高，說明該方法穩(wěn)定可行。

3 結 論

實驗結果表明，雙水相中P E G 4 0 0質(zhì)量分數(shù)、Na2SO4質(zhì)量分數(shù)、pH值、KCl添加量及溫度等因素都對雙水相體系的相比、分配系數(shù)及黃酮的萃取率有一定影響，實驗確定萃取分離狗棗獼猴桃葉黃酮的雙水相體系組成為24% PEG400和15% Na2SO4；黃酮粗提液質(zhì)量濃度和pH值對黃酮萃取效果影響最大，其次為KCl添加量，而溫度的影響較小。最佳萃取條件是3mL質(zhì)量濃度為C0(即3.4284mg/mL)的粗提液、KCl添加量2%、pH9、溫度25℃，萃取率可達0.9690。本實驗采用PEG-Na2SO4雙水相體系萃取分離狗棗獼猴桃葉黃酮是可行的。

該法具有萃取率高、分相快、溫度低、易于操作等優(yōu)點，為黃酮類化合物萃取分離的一種有效方法。但目前對該技術的研究還不成熟，其過程仍存在易乳化；水溶性高聚物大多黏度較大；不易定量控制；高聚物回收困難等問題[15]，因此還有待進一步研究。

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Optimization of Aqueous Two-phase Extraction of Total Flavonoids from Actinidia kolomikta Leaves

WANG Qian，JIA Chang-hong*，CHANG Li-xin，TANG Hong-mei
(College of Life Sciences, Hebei United University, Tangshan 063009, China)

An aqueous two-phase system composed of 24% PEG400 and 15% Na2SO4was used to extract total flavonoids from the crude ethanol extract of Actinidia kolomikta leaves. The effects of crude extract concentration, KCl amount, pH and extraction temperature on the extraction efficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The results showed that crude extract concentration and pH were major affecting factors and KCl, and extraction temperature exhibited less effect on the extraction efficiency of total flavonoids. The optimal aqueous two-phase extraction conditions were crude extract concentration of C0, KCl amount of 2%, pH of 9 and extraction temperature of 25 ℃. Under the optimal extraction conditions, total flavonoids from Actinidia kolomikta leaves was mainly distributed in the upper phase with a distribution coefficient of 24.31 and an extraction rate of 96.90%. Therefore, this method can provide a simple, convenient, economical and highly efficient strategy for the extraction of total flavonoids.

aqueous two-phase system；extraction and purification；Actinidia kolomikta leaves；flavonoids

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0167-05

2010-11-06

河北省科技支撐計劃項目(07220701D-5)

王倩(1982—)，女，碩士研究生，研究方向為植物天然活性成分。E-mail：wqvictor2008@sohu.com

*通信作者：賈長虹(1966—)，女，副教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：jiachanghong66@163.com