杜 彬，王同坤，侯文龍，牛少莉，楊越冬*

(河北科技師范學院 分析測試中心，河北 秦皇島 066004)

板栗花中總多酚提取工藝優(yōu)化

杜 彬，王同坤，侯文龍，牛少莉，楊越冬*

(河北科技師范學院 分析測試中心，河北 秦皇島 066004)

研究板栗花中多酚類物質的最佳提取工藝條件。采用傳統(tǒng)回流加熱法對板栗花中多酚類物質進行提取試驗研究，通過4種不同試劑在相同實驗條件下的浸提效果進行比較分析，確定最佳提取試劑為甲醇。然后分別對微波浸提法和超聲波浸提法提取板栗花中多酚類物質的工藝進行比較研究，通過對甲醇體積分數(shù)、浸提時間、料液比等單因素的浸提效果進行研究，確定最佳單因素水平，再通過正交試驗分別確定以甲醇為浸提劑提取板栗花中多酚類化合物的最佳提取工藝條件。通過驗證實驗確定最佳提取方法為微波浸提法，最后提取條件為40%甲醇溶液、提取時間60s、微波功率480W、料液比1∶25(g/mL)，在此條件下，多酚得率為6.69%。

板栗花；總多酚；提取工藝；優(yōu)化

板栗花為殼斗科(Fagceae)栗屬植物栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序。板栗具有雌花少，雄花多的特點，雌雄花比達1∶2349，造成板栗產量低，為了提高板栗產量，常需要疏除雄花[1]。近年來，隨著板栗栽培面積的迅速擴大，產量急劇增加，板栗雄花日益增多，成為板栗生產中的廢棄物，造成極大的資源浪費。研究發(fā)現(xiàn)，板栗花中含有豐富的黃酮類物質[2]，但對板栗花中多酚類物質的研究尚未見報道。研究顯示多酚類物質具有多種藥理功能如抗炎癥、抗病原體、抗誘變劑、抗癌、減少心血管疾病和抗氧化性質[3-4]，在食品、醫(yī)藥以及保健品等方面起到了一定的作用[5]。

目前，對多酚類物質的研究主要集中在茶葉、水果等方面，對板栗花中多酚類物質的研究尚未見報道，開展多酚類的研究，對于合理開發(fā)利用板栗花資源具有重要意義。微波輔助提取是農產品有效成分提取的一項新技術。目前，微波提取已被廣泛應用于中草藥有效成分、茶多酚及水果多酚的提取中[6]，本實驗分別通過單因素和正交試驗，以多酚得率為指標，比較微波浸提法和超聲波浸提法對板栗花中多酚類物質的提取效果，探討板栗花中總多酚提取的最佳工藝參數(shù)，以期得到一種簡單、高效的板栗花多酚提取工藝，為板栗花綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕龍板栗花采自河北科技師范學院園藝實驗站，經干燥，粉碎，過4 0目篩，備用。

沒食子酸、福林-肖卡試劑、碳酸鈉、無水甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SP-723型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SF6-01B型電熱恒溫鼓風干燥箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；FZ102微型植物試樣粉碎機 河北省黃驊市齊家務科學儀器廠；FA2104型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；格蘭仕D8023CTL-K4微波爐 佛山市格蘭仕微波爐儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

板栗花→烘干→粉碎→過篩→微波/超聲波浸提→過濾→得到板栗花提取液

前處理好的板栗花樣品分別用微波浸提法和超聲波浸提法處理，提取后過濾，然后吸取濾液定容，用比色法測定吸光度，并計算總多酚得率。

1.3.2 標準曲線的確定

稱取干沒食子酸0.5g(準確至0.0001g)，用水溶解并定容于100mL容量瓶中，搖勻得到0.5%母液。分別取上述沒食子酸標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.5mL，于50mL容量瓶中稀釋。取5只50mL容量瓶，分別吸取上述溶液0.5mL，各加水20mL，福林-肖卡試劑5mL，混勻，30s～8min內各加入15mL的20%碳酸鈉溶液，混勻后用水定容至50mL。上述溶液在20℃下放置2h，然后用分光光度計測定各溶液在765nm波長處的吸光度[7]。經SPSS11.5軟件處理數(shù)據(jù)，得到標準曲線方程：y= 5.5626χ-0.046，R2=0.998。

1.3.3 板栗花中總多酚含量的測定

稱取1.5g(準確至0.0001g)經干燥、粉碎的板栗花，分別經過微波浸提法或是超聲波浸提法處理后，過濾提取液，并收集提取液，吸取上述提取液0.5mL，加水20mL，福林-肖卡試劑5mL，混勻，30s～8min內加入15mL的20%碳酸鈉溶液，混勻后用水定容至50mL。將上述溶液在20℃放置2h，在765nm波長處測定吸光度，然后代入回歸方程，求出提取液中總多酚類物質的含量，同時做2次平行實驗。按下式計算總多酚得率：

式中：C為總多酚質量濃度/(mg/mL)；50為提取液定容體積/mL；V1為按一定料液比所得體積/mL；V2為吸取提取液體積/mL；m為原料質量/g。

1.3.4 板栗花中總多酚最佳提取劑的確定

以體積分數(shù)為30%的乙醇、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯4種溶劑做提取劑[8]，相同條件下對板栗花進行提取、過濾、定容，然后測定吸光度，計算總多酚得率進行比較，確定適宜的提取劑。

1.3.5 微波浸提法工藝優(yōu)化

稱取板栗花粉末1.5g(準確至0.0001g)，放入150mL錐形瓶中，在其他條件相同的情況下，考察提取劑體積分數(shù)、料液比、微波功率與浸提時間對提取效果的影響[9-12]。在單因素試驗基礎上進行正交試驗。

1.3.5.1 提取劑體積分數(shù)對板栗花中總多酚提取效果的影響

采用甲醇-水體系作為提取溶劑，提取條件：板栗花粉末樣品1.5g、微波功率480W、料液比1∶20(g/mL)、提取時間60s，甲醇溶液的體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%。對試樣進行過濾，過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.5.2 浸提時間對板栗花中總多酚提取效果的影響

板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、50%甲醇溶液、微波功率480W、料液比1∶20，提取時間為20、40、60、80、100s。對試樣進行過濾，過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.5.3 微波功率對板栗花中總多酚提取效果的影響

板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、50%甲醇溶液、料液比1∶20、提取60s，微波功率分別為160、320、480、640、800W。對試樣進行過濾，過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.5.4 料液比對板栗花中總多酚提取效果的影響

板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、50%甲醇溶液、微波功率為480W、料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30。對試樣進行過濾，過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.6 超聲波浸提法工藝優(yōu)化

取板栗花粉末1.5g(準確至0.0001g)，放入150mL錐形瓶中，在其他條件相同的情況下，考察提取劑體積分數(shù)、超聲波頻率、浸提溫度與浸提時間對提取效果的影響[13-15]。在單因素試驗基礎上進行正交試驗。

1.3.6.1 提取劑體積分數(shù)對板栗花中總多酚提取效果的影響

使用甲醇-水體系作為提取溶劑，提取條件：板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、提取溫度55℃、料液比1∶20(g/mL)、超聲波頻率32kHz、提取時間50min。甲醇溶液的體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%。過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.6.2 超聲波頻率對板栗花中總多酚提取效果的影響

板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、溶劑為50%甲醇溶液、料液比1∶20、提取溫度55℃、提取時間50min，超聲波頻率分別16、20、24、32、40kHz。過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.6.3 浸提溫度對板栗花中總多酚提取效果的影響

板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、溶劑為50%甲醇溶液、料液比1∶20、提取時間50min、超聲波頻率32kHz，提取溫度分別為25、35、45、55、65℃。過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

1.3.6.4 浸提時間對板栗花中總多酚提取效果的影響

板栗花粉末樣品1.5g(準確至0.0001g)、溶劑為50%甲醇溶液、料液比1∶20、提取溫度55℃、超聲波功率32kHz，提取時間分別為20、30、40、50、60min。過濾后定容，測定濾液的吸光度，并計算出提取液中總多酚物質的含量及總多酚得率。

2 結果與分析

2.1 板栗花中總多酚最佳提取劑的確定

表1 不同提取劑對提取效果的影響Table 1 Effect of different extraction solvents on extraction rate of total polyphenols

由表1可知，當提取劑為甲醇時提取效果最佳，故本實驗采用甲醇作為提取溶劑，進行微波浸提法與超聲波浸提法的比較。

2.2 微波浸提法單因素試驗

2.2.1 提取劑體積分數(shù)對板栗花中總多酚得率的影響

由圖1可知，板栗花中總多酚得率隨著甲醇體積分數(shù)的增加而升高，并在甲醇體積分數(shù)達到50%左右時達到最大峰值，此后板栗花中總多酚得率開始下降，在甲醇體積分數(shù)達到60%以后，板栗花中總多酚得率變化比較平緩，造成這種原因可能是由于部分多酚是水溶性的，如果水分減少，多酚就不能充分溶解，造成多酚得率的下降。

圖1 提取劑體積分數(shù)對微波法提取板栗花中總多酚效果的影響Fig.1 Effect of methanol concentration on microwave-assisted extraction rate of total polyphenols

2.2.2 浸提時間對板栗花中總多酚得率的影響

圖2 浸提時間對微波法提取板栗花中總多酚效果的影響Fig.2 Effect of microwave extraction time on extraction rate of total polyphenols

由圖2可知，隨著提取時間的增加，板栗花中總多酚得率隨之增加，在40s以后，板栗花中總多酚得率開始下降，這說明在40s左右的提取時間提取板栗花中的總多酚比較經濟合理。

2.2.3 微波功率對板栗花中總多酚得率的影響

圖3 微波功率對板栗花中總多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of total polyphenols

由圖3可知，在微波功率480W以前，微波功率對板栗花中總多酚得率影響較小，此后總多酚得率開始小幅下降，在微波功率達到800W時，總多酚得率又緩慢回到480W以前水平。由此可以反映出在微波功率480W左右時，提取板栗花中的總多酚比較合理。

2.2.4 料液比對板栗花中總多酚得率的影響

圖4 料液比對板栗花中總多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on microwave-assisted extraction rate of total polyphenols

由圖4可知，隨著料液比的增加，總多酚得率也是增加的。在料液比達到1∶20以后，總多酚得率緩慢下降，當料液比達到1∶25以后總多酚得率開始迅速下降，所以在料液比為1∶20提取板栗花中的總多酚比較合理。

2.3 微波浸提法正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，按L16(45)正交試驗設計表做板栗花中總多酚提取的正交試驗，因素水平見表2，結果與分析見表3。

表2 板栗花中總多酚提取微波浸提法正交試驗因素水平表Table 2 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing microwave-assisted extraction of total polyphenols

表3 微波浸提法正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal array design for optimizing microwave-assisted extraction of total polyphenols and corresponding experimental results

從表3極差分析可知，各因素對板栗花中總多酚得率的影響次序為B＞D＞A＞C，即提取時間(B)為主要影響因素，其余依次為料液比(D)、甲醇體積分數(shù)(A)、微波功率(C)。各因素的最佳組合水平為A2B3C3D3，即提取溶劑40%甲醇溶液、料液比1∶25、微波功率480W、提取時間60s。

2.4 超聲波浸提法單因素試驗

2.4.1 提取劑體積分數(shù)對板栗花中總多酚得率的影響

圖5 提取劑體積分數(shù)對超聲波法提取板栗花中總多酚效果的影響Fig.5 Effect of methanol concentration on ultrasonic-assisted extraction rate of total polyphenols

由圖5可知，在甲醇體積分數(shù)為40%左右時，板栗花中總多酚得率達到峰值，與微波浸提法很相似，此后，總多酚得率隨著甲醇體積分數(shù)的提高而下降?？梢苑从吵鲈诩状俭w積分數(shù)為40%時提取板栗花中總多酚比較合理。

2.4.2 超聲波頻率對板栗花中總多酚得率的影響

圖6 超聲波頻率對板栗花中總多酚提取效果的影響Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on extraction rate of total polyphenols

由圖6可知，超聲波頻率對與板栗花中總多酚的提取是有一定影響的，隨著超聲波頻率的增加，總多酚得率提高，在超聲波頻率達到32kHz以后，總多酚得率增幅減小，在超聲波頻率40kHz時，提取效果最好。

2.4.3 浸提溫度對板栗花中總多酚得率的影響

由圖7可知，隨著提取溫度的升高，板栗花中的總多酚得率也是逐漸增加的，這是因為在較高溫度下浸提，可以提高溶質中總多酚物質的擴散速度，分子運動速度加快，氫鍵更容易斷裂，多酚的浸透、溶解、擴散速度也加快，因而酚類物質更容易從原料中浸出，但是當溫度過高，達到55℃以后，多酚物質結構可能被破壞，造成總多酚得率下降。

圖7 浸提溫度對板栗花中總多酚提取效果的影響Fig.7 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total polyphenols

2.4.4 浸提時間對板栗花中總多酚得率的影響

圖8 浸提時間對超聲波法提取板栗花中總多酚效果的影響Fig.8 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of total polyphenols

由圖8可知，在50min內，隨著提取時間的增加，板栗花中的總多酚得率也逐漸增加，當達到50min后，總多酚得率有所下降。這可能是在一定范圍內，延長提取時間，有利于板栗花中多酚物質的浸出，但若提取時間過長，可能會引起多酚物質的縮合，或被空氣中的氧氣氧化，造成總多酚得率反而降低。

2.5 超聲波浸提法正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，擬定4因素3水平，按L16(45)正交試驗設計表做板栗花中總多酚超聲波浸提法正交試驗，因素水平見表4，結果與分析見表5。

表4 板栗花中總多酚超聲波波浸提法正交試驗因素水平表Table 4 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing ultrasonic-assisted extraction of total polyphenols

表5 超聲波浸提法正交試驗結果與分析Table 5 Orthogonal array design for optimizing ultrasonic-assisted extraction of total polyphenols and corresponding experimental results

從表5極差分析可知，各因素對板栗花中總多酚多酚得率的影響次序為C＞A＞D＞B，即浸提溫度(C)為主要影響因素，其余依次為甲醇體積分數(shù)(A)、浸提時間(D)、超聲波頻率(B)。各因素的最佳組合水平為A2B2C3D2，即提取溶劑40%甲醇溶液、超聲波頻率32kHz、浸提溫度65℃、浸提時間50min。

2.6 兩種提取方法最優(yōu)條件的比較

在兩種提取方法的單因素試驗基礎上，通過正交試驗，得到兩種提取方法的最優(yōu)條件，對兩種提取方法分別按照1.3.3節(jié)方法進行驗證比較實驗。

表6 兩種提取方法最優(yōu)條件對比Table 6 Comparisons of optimal operating conditions and total polyphenol yield between microwave-assisted extraction and ultrasonic-assisted extraction

由表6可知，兩種提取方法對比，超聲波浸提法所需溫度較低，相比之下，微波浸提法由于微波浸提法所需時間短，熱效率高，升溫迅速均勻等特點，從而達到了較高的多酚得率。因此微波浸提法是提取板栗花中多酚物質高效簡便的方法。

3 結 論

本實驗比較了不同溶劑對板栗花中多酚類物質的提取效果，結果顯示，甲醇為最佳提取溶劑。在此基礎上，對微波浸提法和超聲波浸提法兩種提取方法提取板栗花中多酚類物質的提取效果的進行對比，得到結論，微波浸提法為板栗花中多酚類物質的最佳提取工藝。結果表明，提取時間和料液比是影響板栗花中多酚類物質提取效果的關鍵因素，其次才是微波功率和甲醇體積分數(shù)等因素。確定了微波浸提法提取板栗花中多酚類物質的最佳工藝條件：甲醇體積分數(shù)40%、料液比1∶25、提取時間60s、微波功率480W，多酚得率6.69%。對板栗花中含有的多酚類功能性成分的提取研究，為富含該類物質的板栗廢棄物板栗花的綜合開發(fā)利用提供了新的途徑。

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Process Optimization for Extraction of Total Polyphenols from Chinese Chestnut Flowers

DU Bin，WANG Tong-kun，HOU Wen-long，NIU Shao-li，YANG Yue-dong*
(Analysis and Testing Center, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, China)

In this study, the optimal extraction conditions of total polyphenols from the flowers of Chinese chestnut cultivar Yanlong were investigated. The traditional heating reflux method was used for the extraction of total polyphenols. Four different extraction solvents were applied for the extraction of polyphenols. The results indicated that methanol was the best extraction solvent, and microwave was superior to ultrasonic in enhancing the extraction of total polyphenols. The optimal process parameters for microwave-assisted extraction of total polyphenols were determined by orthogonal array design to be 40% methanol as the extraction solvent, microwave treatment time of 60 s, microwave power of 480 W and material-to-liquid ratio of 1∶25 (g/mL). Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total polyphenols from chestnut flowers was up to 6.69%.

Chinese chestnut flower；polyphenols；extraction；optimization

TQ243.11

A

1002-6630(2011)16-0121-06

2010-10-30

河北省科技支撐計劃項目(09231005D)；河北省重點基礎研究項目(09960912D)；河北省自然科學基金項目(C2010001523)

杜彬(1980—)，男，實驗師，碩士，研究方向為天然產物化學。E-mail：trueyeoman@163.com

*通信作者：楊越冬(1965—)，女，教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：kycyyd@yahoo.com.cn