陳繼光，米麗雪，上官新晨*，李 翔，鐘世根

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

青錢柳愈傷組織總黃酮堿溶酸沉提取工藝

陳繼光，米麗雪，上官新晨*，李 翔，鐘世根

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

目的：研究以堿溶酸沉法提取青錢柳愈傷組織中的總黃酮。方法：采用堿溶酸沉法，對影響青錢柳愈傷組織中總黃酮提取的pH值、固液比、提取時間、硼砂用量等因素進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果：青錢柳愈傷組織中總黃酮堿提酸沉的最佳提取工藝為：采用固液比1∶20，堿提液pH9，硼砂含量2.5%，提取時間60min，酸沉pH 4.5。結(jié)論：在最佳提取工藝下，青錢柳愈傷組織中總黃酮得率達(dá)到4.01%。

青錢柳；愈傷組織；總黃酮；堿溶酸沉

青錢柳系雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬喬木植物，為我國特有[1]。研究表明[2-6]青錢柳含有豐富的天然藥用成分，如多糖、黃酮、酚類、植物蛋白、皂苷、香豆精、生物堿、甾體、萜類、苷類、有機(jī)酸、胡蘿卜素、VE、咖啡因等及一些人體必需的微量元素?！吨袊兴庂Y源志要》記載，其樹皮、葉具有清熱消腫、止痛的功能，可用于治療頑癬，長期以來民間用其葉片做茶[7]。李磊等[8-12]研究表明青錢柳嫩葉茶具有生津止渴、清熱解暑、降壓降脂血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗氧化防衰老的作用，可有效地用于防治糖尿病、高血壓、冠心病及神經(jīng)衰弱等疾病。

黃酮類化合物分子中含有多個酚羥基，一般顯弱酸性，在堿性溶液中，黃酮類化合物易開環(huán)生成查耳酮型結(jié)構(gòu)而多呈黃色、橙色或褐色，其機(jī)制是黃酮類化合物在堿性條件下苯并吡喃酮的1、2碳之間的C—O鍵開環(huán)成查耳酮型結(jié)構(gòu)所致；在酸性條件下，查耳酮又恢復(fù)為閉環(huán)結(jié)構(gòu)，黃色消失[13]。黃酮化合物經(jīng)典的提取方法為有機(jī)溶劑提取法，尤其是醇提法。如董彩軍[14]采用乙醇-水作為提取劑提取青錢柳葉中黃酮類化合物，其總黃酮得率為22.04mg/g。堿溶酸沉法相對醇提取法提取率稍低，但堿溶酸沉法具有工藝、設(shè)備簡單，操作方便，產(chǎn)品安全，無環(huán)境污染，不使用有機(jī)溶劑，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。劉金香等[15]利用堿溶酸沉法提取銀杏葉總黃酮，使銀杏葉總黃酮的提取率達(dá)到86.4%。目前，青錢柳愈傷組織中總黃酮的提取未見文獻(xiàn)報道，筆者在超聲條件下采用堿提酸沉法對青錢柳愈傷組織總黃酮進(jìn)行提取并測定總黃酮得率，并確定了提取工藝的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將青錢柳葉子接于附加0.5mg/L NAA和1.0mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，于溫度25℃，光強(qiáng)2000lx，黑暗培養(yǎng)7～10d后，再進(jìn)行光暗交替12h/12h的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)青錢柳愈傷組織。

形成的愈傷組織繼代培養(yǎng)于含30mL固體培養(yǎng)基的100mL的培養(yǎng)瓶中，MS＋0.3mg/L 2,4-D＋0.5mg/L KT＋3%蔗糖的培養(yǎng)基上，2周繼代1次。在晝夜溫度25℃，光強(qiáng)2000lx，光暗交替12h/12h的條件下培養(yǎng)。

氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、正丁醇、乙酸乙脂、9 5%乙醇、四硼酸鈉、鹽酸、氧化鈣等均為市售分析純；蘆丁 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；754型PC紫外可見分光光度計、光譜723型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將收獲的愈傷組織，去除底部瓊脂，60℃烘干至恒質(zhì)量，研磨后過100目篩網(wǎng)，裝入密封袋放入干燥器中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取1 2 0℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，加80%乙醇溶解，定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.3 最大吸收峰的確定

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液各2mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液0.3mL后，靜置6min，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液0.3mL，靜置6min后，再加入濃度1mol/L NaOH溶液4mL，分別用60%乙醇定容至10mL，搖勻，放置15min，用紫外可見分光光度計在400～700nm進(jìn)行全波長掃描，最大吸收峰在503nm處。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

精密吸取標(biāo)品質(zhì)量濃度0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL，分別置于10mL試管中，加5% NaNO20.3mL，放置6min后，加10% Al(NO3)30.3mL，放置6min，再加4%氫氧化鈉4mL，加水定容到10mL并搖勻，放置15min。根據(jù)最大吸收波長做標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同質(zhì)量濃度下的吸光度經(jīng)最小二乘法作線性回歸，得回歸方程C＝0.1009A＋0.0005，R2＝0.996。

1.3.5 青錢柳愈傷組織總黃酮提取

精密稱取500mg粉末于具塞試管中，加入3.5%硼砂，加入10mL pH9.0的飽和石灰水在60℃超聲提取1h，抽濾后將濾液pH值調(diào)至4.5，將調(diào)好酸后的提取液加入10mL乙酸乙酯、正丁醇分別萃取2次。將乙酸乙酯萃取液與正丁醇萃取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，加入一定量95%乙醇，超聲溶解，并定容于10mL容量瓶中，待測液制好備用。

1.3.6 青錢柳組織細(xì)胞培養(yǎng)物中總黃酮得率測定

用NaNO2-Al(NO3)3比色體系檢測青錢柳愈傷組織中總黃酮的得率。取0.1mL上述方法制備好的待測液于10mL具塞試管中按照標(biāo)準(zhǔn)品的顯色方法處理，測定其吸光度，并代入回歸方程計算樣品中的總黃酮得率。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

式中：M為青錢柳組織細(xì)胞培養(yǎng)物干粉的質(zhì)量/mg；A為吸光度；V為提取后定容的體積/mL；

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，V6.55專業(yè)版。

2 結(jié)果與分析

2.1 固液比對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響

在60℃、硼砂用量3.5%、石灰水pH9.0、超聲提取時間60min、酸沉pH4.5的條件下，選取固液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，考察固液比對青錢柳愈傷組織總黃酮得率的影響，不同固液比的提取結(jié)果見圖2。

圖2 固液比對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

由圖2可知，當(dāng)固液比小于1∶20時，得率較低，而隨著固液比的增大，青錢柳愈傷組織中總黃酮得率增大，且在1∶20時到達(dá)最大為4.06%；固液比大于1∶20時，總黃酮得率趨于平緩下降。這可能是由于固液比增大可以增加物料與溶劑的接觸面積，使得黃酮類物質(zhì)在更充分的溶解出來的同時也被部分水解[16]，所以確定最佳固液比為1∶20。

2.2 不同堿性提取液pH值對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響

由于青錢柳黃酮類化合物含有酚羥基，具有弱酸性。因此提高提取溶劑的堿性對提取有利。用稀鹽酸溶液調(diào)氫氧化鈣溶液pH值分別為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 堿性提取液pH值對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction pH value on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

由圖3可知，隨著pH值增大，試樣中黃酮得率增加，而后又減小，在pH10.0時，黃酮得率達(dá)到最大為4.03%。因青錢柳葉片所含黃酮類物質(zhì)主要是山萘酚、槲皮素、異鼠李素等苷類化合物[17]，其結(jié)構(gòu)均含有多個酚羥基，呈一定酸性，與稀Ca(OH)2溶液反應(yīng)，可生成易溶于水的鹽類，因此，堿用量增加，pH值增大，黃酮類物質(zhì)溶解量增多，提取液中黃酮得率相應(yīng)提高。但如堿液濃度過高或溶液pH值過大，黃酮母核遭到破壞，而致黃酮得率下降。

2.3 硼砂用量對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響

圖4 硼砂用量對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of borax amount on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

青錢柳總黃酮分子中含有鄰二酚羥基，在空氣中易被光分解而變?yōu)榘岛稚?，在堿性條件下更易被氧化分解，硼酸鹽能與鄰二酚羥基結(jié)合而達(dá)到保護(hù)的目的，因此在用堿液加熱提取黃酮時，往往加入少量硼砂作為保護(hù)試劑以減少其所含黃酮類化合物氧化分解。

由圖4可知，總黃酮得率隨硼砂用量的增加呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)硼砂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時，總黃酮得率達(dá)到最大值為3.65%。因此，選擇硼砂含量為2.5%可達(dá)較好的提取效果。

2.4 提取時間對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響

圖5 提取時間對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響Fig. 5 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

從圖5可以看出，隨著提取時間的增加總黃酮得率也增加，但時間達(dá)到60min時，黃酮得率最高為3.78%。隨著時間的增加，得率反而下降，這可能是因?yàn)殡S著提取時間的增加，黃酮類物質(zhì)發(fā)生氧化、分解而導(dǎo)致得率下降。另外，媒質(zhì)里的其他雜質(zhì)也大量溶出使總黃酮百分含量下降，同時也增加能耗。

2.5 酸沉pH值對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮提取得率的影響

圖6 酸沉pH值對青錢組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響Fig. 6 Effect of acid precipitation pH value on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

為了盡可能回收黃酮類化合物，用稀HCl溶液將堿性石灰水提取液調(diào)節(jié)pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。由圖6可看出，在酸性范圍內(nèi)，隨酸度減小，樣品中黃酮類化合物含量隨之增加，而后酸度再減小其含量也隨之減小，在pH4.5時，達(dá)到最高為3.93%。由于黃酮類化合物可溶于堿性溶液，加酸時又沉淀析出，故隨酸度增大，黃酮類物質(zhì)析出量相應(yīng)增多。但因黃酮母核中吡喃環(huán)上的氧原子有一定堿性，在酸性較強(qiáng)時，易形成鹽而溶解，導(dǎo)致部分黃酮損失。

2.6 堿提酸沉法提取青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮的正交試驗(yàn)設(shè)計

表1 L9(34)青錢柳愈傷組織提取正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results for optimal extraction of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

表2 黃酮得率正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis for extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus with various process conditions

表3 Duncan新復(fù)極差法多重比較Table 3 Duncan multiple comparison of total flavonoids extraction rate

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，以石灰水溶液為提取劑，選取堿性提取液pH值、硼砂用量及提取時間、酸沉pH值4個因素為考察因素，以青錢柳愈傷組織中總黃酮得率為指標(biāo)，確定各正交設(shè)計因素的水平，按L9(34)正交表對堿法提取工藝進(jìn)行研究，確定青錢柳愈傷組織總黃酮堿法提取的最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表1，利用DPS軟件通過極差分析、方差分析和Duncan新復(fù)極差法多重比較，優(yōu)選出堿提酸沉法提取青錢柳組織中總黃酮的最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)設(shè)計的各因素水平及結(jié)果見表1。

從表1數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，影響青錢柳愈傷組織中總黃酮得率各因素主次關(guān)系為：D＞B＞C＞A。其中硼砂含量、酸沉pH值和提取時間對青錢柳愈傷組織中總黃酮得率影響極顯著，堿液pH值對青錢柳愈傷組織中總黃酮提取影響不顯著。因此，綜合極差和Duncan分析結(jié)果，得到青錢柳愈傷組織中總黃酮提取最優(yōu)工藝參數(shù)為A1B2C2D2，即堿液pH9、硼砂含量2.5%、提取時間60min、酸沉pH4.5。

2.7 提取次數(shù)和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

在正交優(yōu)化條件下分別做提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，確定提取級數(shù)對青錢柳組織培養(yǎng)物中總黃酮得率的影響和優(yōu)化條件的可行性和重現(xiàn)性。

表4 提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Effect of repeated extraction number on extraction rate of total flavonoids

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of reproducibility experiments

表4浸提次數(shù)結(jié)果表明，第1次浸提的青錢柳愈傷組織中總黃酮提取率之和占3次浸提提取率總和的97.4%，從節(jié)約浸提成本的角度考慮，采用一級浸提。表5結(jié)果表明，正交優(yōu)化條件下提取試驗(yàn)的重現(xiàn)性較好(RSD＝2.26%)，黃酮得率達(dá)4.01%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超聲輔助技術(shù)，采用堿液提取法提取青錢柳組織細(xì)胞培養(yǎng)物中的總黃酮，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定了堿提酸沉法提取青錢柳愈傷組織總黃酮的最佳提取條件為：固液比1∶20、堿液pH9、硼砂含量2.5%、提取時間60min、酸沉pH4.5，在此條件下青錢柳愈傷組織中總黃酮得率為4.01%。采用此法，總黃酮得率較高，且使用水為提取溶劑，具有成本低、污染性小等特點(diǎn)．具有較高的實(shí)用價值。

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Optimization of Alkali Extraction and Acid Precipitation Process for Total Flavonoids from Cyclocarya paliurus Callus

CHEN Ji-guang，MI Li-xue，SHANGGUAN Xin-chen*，LI Xiang，ZHONG Shi-gen
(Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

Objective∶ To optimize the alkali extraction and acid precipitation of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus. Methods∶ The effects of pH, material/liquid ratio, borax amount and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus. Results∶ The optimal extraction conditions were extraction solvent pH of 9.0, borax amount of 2.5%, extraction time of 60 min, and acid precipitation pH of 4.5. Conclusion∶ Under the optimal conditions, the extraction rate of total flavonoids was up to 4.01%.

Cyclocarya paliurus；callus；total flavonoids；alkali extraction and acid precipitation

S336；O623.59

A

1002-6630(2011)16-0103-05

2010-10-29

江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人項(xiàng)目(2009DD00900)；江西省科技廳支撐項(xiàng)目(2009BSB09100)

陳繼光(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镔Y源利用開發(fā)。E-mail：chenjiguang1@126.com

*通信作者：上官新晨(1962—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail：shangguanxc_818@sina.com