歐陽玉祝，張辭海，薛 慧，吳道宏

(1.林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

超聲協(xié)同雙水相體系提取路邊青總多酚工藝

歐陽玉祝1,2，張辭海2，薛 慧2，吳道宏2

(1.林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

采用超聲協(xié)同乙醇-銨鹽雙水相體系提取路邊青總多酚，通過單因素和正交試驗(yàn)考查料液比、乙醇初始體積與水初始體積比、提取溫度和提取時(shí)間對總多酚提取率的影響。結(jié)果表明：最佳工藝為料液比1∶20(g/mL)、乙醇初始體積與水初始體積比0.8、硫酸銨質(zhì)量濃度0.27g/mL、提取溫度60℃、超聲提取時(shí)間60min，總多酚提取率為3.04%。本法是一種提取效率高，時(shí)間短，能耗低，不影響提取物活性的新工藝。

雙水相體系；超聲波；路邊青；總多酚

路邊青(Herba gei)的葉和莖中含有豐富的植物多酚和黃酮化合物，具有清熱解毒，抗菌消炎，活血解毒等功能[1]，廣泛用于醫(yī)藥、日用化工和食品添加劑領(lǐng)域。目前，國內(nèi)外對路邊青的研究主要是藥物的臨床應(yīng)用[2-3]，化學(xué)成分分析[4]，多酚和黃酮提取及其抗氧化性[5-10]。超聲波輔助提取是一種提取時(shí)間短，提取效率高，能耗低的新提取技術(shù)，廣泛用于天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的提取[11-12]；雙水相體系是一種新型的分離技術(shù)[13-17]，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中生物活性物質(zhì)的分離。本實(shí)驗(yàn)將超聲輔助提取法與乙醇-硫酸銨雙水相體系結(jié)合提取路邊青總多酚，探討提取工藝條件。研究結(jié)果能為路邊青的利用和天然食品添加劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

路邊青于7月采自湖南衡山，新鮮路邊青采回后，經(jīng)洗凈、去根、晾干、切碎后于60℃、0.1MPa真空干燥，用植物粉碎機(jī)粉碎至30目左右備用。無水乙醇、硫酸銨、磷酸氫二鈉、沒食子酸、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀均為國產(chǎn)分析純試劑。

UV-2450型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-250E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FZ102型微型植物粉粹機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；JA2003N型電子天平 上海精密儀器廠；中量制備儀 天津玻璃廠。

1.2 方法

1.2.1 雙水相體系的制備

乙醇-硫酸銨雙水相體系按照文獻(xiàn)[16-17]制備。在無水乙醇中加入一定量的硫酸銨水溶液，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，通過改變乙醇與水的比例和硫酸銨的用量控制雙水相體系的形成。本實(shí)驗(yàn)選擇雙水相體系的乙醇初始體積與水初始體積比為0.67(醇水比)，硫酸銨質(zhì)量濃度0.27g/mL配制雙水相。

1.2.2 雙水相提取路邊青總多酚

以總多酚提取率為目標(biāo)，從提取時(shí)間、料液比、乙醇初始體積與水初始體積比(醇水比)和提取溫度4個(gè)方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。稱取1.0g干燥路邊青粉末于100mL圓底燒瓶中，按一定的料液比加雙水相體系溶液，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，抽濾，濾液靜置，分液，取上層用60%乙醇定容至50mL做為待測液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用沒食子酸作標(biāo)樣，按參考文獻(xiàn)[5]配制系列沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見分光光度計(jì)測波長543nm處的吸光度，繪制質(zhì)量濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸得回歸方程：

C=1.7386A，R2=0.9998

式中：C為總多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；A為溶液的吸光度。

1.2.4 樣品中總多酚的分析

[5]取1mL待測液置于25mL容量瓶中，以酒石酸亞鐵比色法測定總多酚的含量。用紫外可見分光光度計(jì)測波長543nm處的吸光度，結(jié)合回歸方程計(jì)算提取液中總多酚質(zhì)量，并計(jì)算總多酚提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對總多酚提取率的影響

稱取干燥路邊青粉末1.00g，以乙醇作溶劑，采用1.2節(jié)方法按醇水比0.67，分相鹽質(zhì)量濃度(硫酸銨質(zhì)量濃度)0.27g/mL配制雙水相溶液，并按料液比1∶25(g/mL)加雙水相溶液，于50℃溫度超聲提取，考查提取時(shí)間對總多酚提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨提取時(shí)間的增加，總多酚的提取率先增大后減少，45min時(shí)達(dá)到最大值2.86%。這是因?yàn)槎喾踊衔锸軣釙r(shí)間過長被氧化所致。

圖1 提取時(shí)間對總多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on total polyphenol yield

2.1.2 料液比對總多酚提取率的影響

料液比是指路邊青質(zhì)量與雙水相溶液體積之比，提取溶劑包括雙水相中的乙醇和水(下同)，因此，料液比的大小將直接影響提取效果的好壞。為了考查料液比對總多酚提取率的影響，稱取干燥的路邊青粉末1.00g，以乙醇作為溶劑，采用1.2節(jié)方法按醇水比0.67，分相鹽質(zhì)量濃度(硫酸銨質(zhì)量濃度)0.27g/mL配制雙水相溶液，并按不同料液比添加雙水相溶液，于50℃溫度超聲提取30min，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對總多酚提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on total polyphenol yield

由圖2可知，料液比太小或太大都不利于總多酚的提取。料液比以1∶20最好，總多酚提取率為2.57%。因?yàn)橹参锒喾釉诩?xì)胞內(nèi)與糖、蛋白質(zhì)或生物堿通過苷鍵、酯鍵或氫鍵等疏水鍵結(jié)合，要將總多酚浸出，必須破壞疏水鍵。料液比小，溶劑滲透并擴(kuò)散到植物細(xì)胞內(nèi)的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴(kuò)散的速度小，料液比太大，雖然有利于溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，也有利于黃酮化合物向溶劑中擴(kuò)散，但溶劑用量多，會(huì)造成分相鹽用量增大，影響雙水相的穩(wěn)定性，導(dǎo)致黃酮提取率減小。

2.1.3 醇水比對總多酚提取率的影響

醇水比直接影響雙水相的穩(wěn)定性，對總多酚提取率有較大的影響。為了考察醇水比對總多酚提取率的影響，稱取干燥的路邊青粉末1.00g，以乙醇作為溶劑，采用1.2節(jié)方法按分相鹽質(zhì)量濃度(硫酸銨質(zhì)量濃度) 0.27g/mL，在不同醇水比時(shí)配制雙水相，并按料液比1∶25加雙水相溶液，于50℃超聲提取30min，抽濾，濾液按1.3節(jié)方法測定總多酚的含量，計(jì)算總多酚提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 醇水比對總多酚提取率的影響Fig.3 Effect of volume ratio of initial ethanol to initial water on total polyphenol yield

由圖3可知，醇水比為0.7時(shí)最好，總多酚提取率為2.86%。因?yàn)榇妓忍?，水量過多，進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)的提取溶劑對總多酚疏水鍵的斷鍵能力弱，提取率低；醇水比太小，乙醇用量過多，溶劑進(jìn)入植物細(xì)胞的能力差，總多酚提取率也低。

2.1.4 提取溫度對總多酚提取率的影響

溫度升高，分子內(nèi)能增大，有利于溶劑分子滲透到植物細(xì)胞內(nèi)破壞疏水鍵，因此，溫度對總多酚提取率有較大的影響。稱取干燥的路邊青粉末1.00g，以乙醇作為溶劑，采用1.2節(jié)方法按醇水比0.67，分相鹽質(zhì)量濃度(硫酸銨質(zhì)量濃度)0.27g/mL配制雙水相，并按料液比1∶25添加雙水相溶液，于超聲波清洗器中加熱超聲提取30min，抽濾，濾液測定總多酚含量，計(jì)算總多酚提取率，考查提取溫度對總多酚提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對總多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total polyphenol yield

由圖4可知，隨著超聲提取溫度的升高，總多酚提取率增大，到60℃時(shí)達(dá)最大值2.4%，隨后稍有減小。因?yàn)闇囟壬?，分子?nèi)能增大，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于溶劑分子滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞疏水鍵，同時(shí)，也有利于被提取物質(zhì)向溶液中擴(kuò)散。但溫度高于60℃，雙水相體系穩(wěn)定性變差總多酚物質(zhì)的氧化加快。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)雙水相提取總多酚的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、雙水相醇水比、提取時(shí)間和料液比4因素為影響因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 路邊青總多酚提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

2.2.2 路邊青總多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 路邊青總多酚提取L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal array design L9(34) and corresponding experimental results

由表2中正交試驗(yàn)直觀分析表明：各因素影響程度由大到小依次為：A＞D＞B＞C，最優(yōu)水平為A2B2C3D2，即用乙醇作提取溶劑，在料液比1∶20、醇水比0.8、溫度60℃條件下超聲提取60min。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了考查最佳提取條件下總多酚的提取效果，用乙醇為提取溶劑，在醇水比0.8，硫酸銨質(zhì)量濃度0.27g/mL時(shí)配制雙水相，于料液比1∶20、溫度60℃、提取時(shí)間60min條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在最佳條件下，采用超聲協(xié)同乙醇-銨鹽雙水相體系提取路邊青總多酚，提取率為3.04%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均標(biāo)準(zhǔn)相對誤差(RSD)為1.039%。

3 結(jié) 論

超聲協(xié)同雙水相體系提取路邊青中總多酚具有耗時(shí)短、操作簡單、提取與分離同時(shí)完成，不影響多酚活性的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果表明，用乙醇為提取劑，在乙醇初始體積與水初始體積比0.8、硫酸銨質(zhì)量濃度0.27g/mL配制雙水相，按料液比1∶20(g/mL)添加雙水相溶液，于60℃溫度條件下超聲提取60min，總多酚提取率為3.04%。

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Ultrasonic-assisted Two-phase Aqueous Extraction of Total Polyphenols from the Shoot of Geum japonicum Thunb. var. chinense F. Bolle

OUYANG Yu-zhu1,2，ZHANG Ci-hai2，XUE Hui2，WU Dao-hong2
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Zhangjiajie 416000, China；2. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

The shoot of Geum japonicum Thunb. var. chinense F. Bolle was ultrasonified in ethanol-ammonium salt two-phase aqueous system to accelerate the extraction of total polyphenols. Operating parameters such as solid-to-liquid ratio, volume ratio of initial ethanol to initial water, temperature and extraction time were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods for maximizing the extraction yield of total polyphenols. Solid-to-liquid ratio of 1∶20 (g/mL), volume ratio of initial ethanol to initial water of 0.8, ammonium sulfate concentration of 0.27g/mL, extraction temperature of 60 ℃ and extraction time of 60 min were found optimal. Under the optimal extraction conditions, the extraction yield of total polyphenols was 3.04%. This method can provide a novel approach for the extraction of total polyphenols with highly efficient, time-saving and energy-saving benefits and no impact on the biological activity of extracts.

two-phase aqueous system；ultrasonic；Geum japonicum Thunb. var. chinense F. Bolle；total polyphenols

TS201.2

A

1002-6630(2011)16-0089-04

2011-05-06

林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(JDZ201107)

歐陽玉祝(1956—)，男，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)品開發(fā)與功能食品研究。E-mail：ouyang1227@126.com