趙夢(mèng)丹，王仁雷，周 峰，周泉澄，周紅霞，華 春,*，李建玲

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171；3.江蘇教育學(xué)院生物系，江蘇 南京 210013)

鹽角草總黃酮提取工藝優(yōu)化

趙夢(mèng)丹1,2，王仁雷3，周 峰2，周泉澄2，周紅霞2，華 春2,*，李建玲1

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171；3.江蘇教育學(xué)院生物系，江蘇 南京 210013)

采用分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定鹽角草中的總黃酮含量。通過(guò)單因素試驗(yàn)分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、回流時(shí)間及回流溫度4個(gè)主要因素對(duì)鹽角草中總黃酮提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化鹽角草總黃酮提取工藝條件。結(jié)果表明：鹽角草總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶50、回流溫度70℃、提取時(shí)間4h。此條件下鹽角草的總黃酮得率25.172mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能為今后鹽角草資源的開(kāi)發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)。

鹽角草；總黃酮；熱回流提??；正交試驗(yàn)

鹽角草(Salicornia europae a L.)，隸屬藜科(Chenopodiaceae)鹽角草屬(Salicornia L.)。鹽角草可在含鹽分3%以上的鹽堿灘涂生長(zhǎng)，是地球上最耐鹽的陸生高等植物種之一，在江蘇省灘涂及鹽堿地廣泛分布[1]。鹽角草的嫩枝和嫩莖鮮美多汁，是歐洲居民傳統(tǒng)的時(shí)蔬之一。種子含油量達(dá)到30%，其中不飽和脂肪酸含量十分豐富，亞油酸含量占70%左右，是一種優(yōu)良的鹽土油料作物。鹽角草具有一定的藥用價(jià)值，其嫩尖組織中的微量皂角甙，對(duì)于降低血管壁上膽固醇的活性具有明顯作用[2-4]具有降壓、降脂、減肥作用。天然黃酮作為生物活性化合物，具有預(yù)防和治療高血壓及動(dòng)脈硬化、抗肝臟毒、抗炎、抗氧化、抗菌及抗病毒、瀉下作用等[5-8]，已被作為甜味劑、抗氧化劑、天然色素在醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[9-13]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)鹽角草的研究多為對(duì)其耐鹽機(jī)理的研究，對(duì)鹽角草中黃酮成分及提取工藝研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)江蘇鹽城灘涂鹽角草植株中總黃酮提取研究，探討最佳提取工藝，為開(kāi)發(fā)利用天然保健海水蔬菜鹽角草提一定參考，為實(shí)施江蘇沿海開(kāi)發(fā)國(guó)家戰(zhàn)略中有效開(kāi)發(fā)利用鹽堿灘涂奠定基礎(chǔ)[14]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鹽角草2010年9月采于江蘇鹽城灘涂，為藜科(Chenopodiaceae)鹽角草屬(Salicornia L.)鹽角草(Salicornia europaea L.)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；石油醚、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LAC164型電子分析天平(精確至0.0001g) 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；回流提取裝置；索氏提取裝置。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取3 7℃烘箱干燥的鹽角草地上綠色部分粉末50g，過(guò)40目篩，置500mL錐形瓶中，加100mL石油醚脫脂、脫色2h，重復(fù)幾次，至石油醚層幾乎無(wú)色，傾去浸提液，樣品置于通風(fēng)處干燥備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0213g，置100mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，稀釋至刻度，精確量取25mL，置50mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含蘆丁0.1065mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.5、7.5、10.0、12.5mL，分別置于5個(gè)25mL容量瓶中，加30%乙醇補(bǔ)足至12.5mL。再加入5%亞硝酸溶液0.75mL，搖勻，放置5min。精確加入10%硝酸鋁溶液0.75mL，搖勻，放置5min。再精確加入1mol/L的氫氧化鈉溶液10mL，用30%的乙醇溶液定容。放置15min，在波長(zhǎng)510nm測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程A=13.1574C-0.009，r=0.9998。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測(cè)定

精密量取樣品黃酮提取液10mL，置25mL容量瓶中，加入30%乙醇溶液2.5mL。再加入5%亞硝酸溶液0.75mL，搖勻，放置5min。精確加入10%硝酸鋁溶液0.75mL，搖勻，放置5min。再精確加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，用30%的乙醇溶液定容。放置15min，在波長(zhǎng)510nm作測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中的黃酮含量。總黃酮得率為1g原料中總黃酮的質(zhì)量(mg)。

式中：Y為總黃酮得率；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測(cè)試液的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為待測(cè)試液的體積/mL；D為待測(cè)試液的稀釋倍數(shù)；m為鹽角草粉末質(zhì)量/g。

1.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液5mL(0.1065mg/mL)，按1.2.3節(jié)處理，重復(fù)測(cè)定6次，RSD為0.77%。

1.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液5mL(0.1065mg/mL)，鹽角草黃酮提取液10mL，按1.2.3節(jié)處理，每5min測(cè)定1次吸光度，共測(cè)定6次，結(jié)果表明顯色后在30min內(nèi)基本無(wú)變化，RSD為0.139%。

1.2.6 回收率測(cè)定

精密吸取10mL鹽角草黃酮提取液6份，分別置25mL容量瓶中，加入蘆丁對(duì)照品4mL(0.1065mg/mL)，按1.2.3節(jié)處理，平均回收率為99.7%，RSD為0.02%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固液比對(duì)提取效果的影響

固液比(g/mL)為變量(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)，精密稱取1.2.1節(jié)處理的鹽角草地上綠色部分粉末2g，然后放入150mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇，在80℃水浴回流4h。后用濾紙過(guò)濾，濾液待用。按1.2.3節(jié)法測(cè)定總黃酮含量。

圖1 固液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖1可見(jiàn)，溶劑用量對(duì)黃酮得率的影響明顯，隨提取溶劑的增加而先上升后下降。固液比與總黃酮得率的關(guān)系顯著(P＜0.05)。其中固液比為1∶40時(shí)總黃酮得率最高，為23.68mg/g，與其他因素水平差異顯著，因此，固液比為1∶40時(shí)為最佳固液比。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為變量(60%、70%、80%、95%)，按固液比1∶40加入乙醇，其余操作同2.1節(jié)。

由圖2可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響明顯，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而先上升后下降。乙醇體積分?jǐn)?shù)與總黃酮得率的關(guān)系極顯著(P＜0.01)，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)總黃酮得率最高，為21.38mg/g，與其他因素水平差異極顯著(P＜0.01)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%后，總黃酮得率開(kāi)始下降，因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)在80%較好。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.3 不同回流時(shí)間對(duì)提取效果的影響

回流時(shí)間為變量(2、3、4、5、6h)，固液比為1∶40，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，其余操作同2.1節(jié)。

圖3 回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoid

由圖3可見(jiàn)，回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響不是太明顯，但還是可以看出隨著回流時(shí)間的增長(zhǎng)而呈先增加后下降的變化規(guī)律。回流時(shí)間2、3h與總黃酮得率的關(guān)系極顯著(P＜0.01)，與4、5、6h水平差異不顯著(P＞0.05)。其中回流時(shí)間為3h時(shí)總黃酮得率最高，為23.44mg/g。因此，采用的最佳回流時(shí)間為3h。

2.4 不同回流溫度對(duì)提取效果的影響

回流溫度為變量(60、70、80、90℃)，固液比為1∶40，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，回流時(shí)間為3h，其余操作同2.1節(jié)。

圖4 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoid

由圖4可見(jiàn)，提取溫度對(duì)黃酮得率的影響明顯，隨溫度的升高而先上升后下降。提取溫度與總黃酮得率的關(guān)系極顯著(P＜0.01)，其中提取溫度為80℃時(shí)總黃酮得率最高，為23.82mg/g。當(dāng)提取溫度超過(guò)80℃后，總黃酮得率開(kāi)始下降，因此，確定提取溫度為80℃。

2.5 正交試驗(yàn)

選取回流溫度、回流時(shí)間、固液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表2 鹽角草總黃酮提取工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

從表2極值可知，各因素影響的主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞固液比＞回流溫度＞回流時(shí)間。提取鹽角草總黃酮的最佳工藝為A1B3C2D2，即選用回流溫度70℃、回流時(shí)間6h、固液比1∶50、乙醇80%。從節(jié)約能源的角度考慮，回流時(shí)間宜采用4h。按A1B2C2D2組合進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率為25.172mg/g，說(shuō)明所選取的工藝確為最佳工藝。

3 討 論

3.1 通過(guò)單因素和L9(34)正交試驗(yàn)確定提取的最佳工藝條件：選用80%乙醇、回流溫度70℃、固液比1∶50、回流時(shí)間4h。總黃酮得率為25.172mg/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該提取工藝具有穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鹽角草黃酮資源提供了參考。

3.2 本實(shí)驗(yàn)用石油醚除脂、除色素，以乙醇為提取劑[15]，采用了分光光度法[16]，用蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統(tǒng)作顯色劑[17]，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，回歸方程為A＝13.1574C-0.009，r＝0.9998；顯色穩(wěn)定性在0.5h內(nèi)良好，RSD為0.139%；精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.77%；加樣回收率99.7%，RSD為0.02%。

3.3 隨著提取分離技術(shù)的發(fā)展，目前總黃酮的提取方法主要為回流提取法、超聲法、微波輔助提取法、酶解輔助提取法和超臨界CO2萃取法。從安全性和實(shí)用性考慮，回流提取法仍然非常有優(yōu)勢(shì)。它方法簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、成本低廉，最重要的是更易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

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Process Optimization for Extraction of Total Flavonoids from Salicornia europaea L.

ZHAO Meng-dan1,2，WANG Ren-lei3，ZHOU Feng2，ZHOU Quan-cheng2，ZHOU Hong-xia2，HUA Chun2,*，LI Jian-ling1
(1. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 211171, China；3. Biology Department, Jiangsu Institute of Education, Nanjing 210013, China)

In this study, one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize the conditions for hot reflux extraction of total flavonoids from the shoot of Salicornia europaea L. The determination of total flavonoids was spectrometrically carried out using rutin as the reference standard. The optimal conditions for extracting total flavonoids from the shoot of Salicornia europaea L. were 80% ethanol as the extraction solvent, solid/liquid ratio 1∶50, extraction temperature 70℃, and extraction time 4 h, resulting in a total flavonoid yield of 25.172 mg/g.

Salicornia europaea L.；total flavonoids；hot reflux extraction；orthogonal test

O623.54

A

1002-6630(2011)16-0085-04

2011-04-02

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(KJD180118)；江蘇省植物生理學(xué)精品課程建設(shè)項(xiàng)目(2010)；江蘇省現(xiàn)代教育技術(shù)研究重點(diǎn)課題(2010)

趙夢(mèng)丹(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镔Y源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：zhaomengdan915@hotmail.com

*通信作者：華春(1963—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)橹参锷韺W(xué)。E-mail：hc3501988@163.com