高新躍 任從才 韓京軍

血紅素加氧酶-1(HO-1)，是HO家族中最重要的酶，為誘導(dǎo)型酶［1］。生理狀態(tài)下，消化道中的HO同工酶主要為HO-2，而HO-1在腸組織中不表達(dá)，只有在缺血缺氧等刺激下才開始分泌HO-1［2，3］。本實驗室已經(jīng)證明，利用基因工程原理合成HO-1重組乳酸乳球菌，對正常大鼠灌胃后能夠到達(dá)回腸組織，原位分泌大量重組HO-1，對失血性休克和/或內(nèi)毒素血癥大鼠，有較好的腸黏膜屏障保護(hù)效應(yīng)，明顯減少腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生程度［4-9］。同時也證明，HO-1重組乳酸乳球菌對正常大鼠灌胃，單純增加灌胃劑量和次數(shù)不能有效增加回腸

HO-1的表達(dá)，反而可能使回腸HO-1的表達(dá)降低［10］。本實驗在上述實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究HO-1重組乳酸乳球菌對正常大鼠灌胃后，是否影響腸黏膜屏障功能?

1 資料與方法

1.1 藥品和試劑 HO-1重組乳酸乳球菌，本實驗室構(gòu)建合成。磷酸鹽緩沖液(PBS)，湖北省武漢博士德生物試劑有限公司出品;乳酸乳球菌素(Nisin)，美國Sigma公司出品;髓過氧化物酶(MPO)活性試劑盒，江蘇省南京建成生物試劑公司出品，其余試劑為市售。

1.2 動物分組 健康、清潔級標(biāo)準(zhǔn)的雄性SD大鼠40只，體重在280～320 g之間，由江蘇省徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。根據(jù)數(shù)字隨機表法分為5組:HO-1重組乳酸乳球菌灌胃1次組(HO1t組，n=8)、HO-1重組乳酸乳球菌灌胃2次組(HO2t組，n=8)、HO-1重組乳酸乳球菌灌胃三次組(HO3t組，n=8)、PBS溶液灌胃1次組(PBS1t組，n=8)和乳酸乳球菌灌胃1次組(LL1t組，n=8)。各組灌胃劑量的容積均為1 ml，每次灌胃間隔24 h。所有動物均在實驗前適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境7 d，自由飲食，單獨飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境和實驗室環(huán)境溫度保持在22℃ ～25℃之間。

1.3 灌胃劑量 將Nisin誘導(dǎo)表達(dá)3 h的HO-1重組乳酸乳球菌，離心(8000 g，5min)收獲菌液，PBS洗3次(10000 g，1 min)棄上清后，再加入適量的PBS使菌液濃縮10倍(活菌數(shù)達(dá)5×109CFU/ml)，用1 m l的細(xì)菌懸浮液作為一次灌胃的劑量。在同樣條件下培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的乳酸乳球菌NZ9000，取1 ml的細(xì)菌懸浮液作為一次灌胃的劑量。PBS溶液灌胃一次組，用1 ml PBS溶液做為灌胃劑量。

1.4 組織標(biāo)本的收集 于末次灌胃后24 h，使用過量水合氯醛麻醉動物，無菌條件下打開胸腹腔，從大鼠的右心室抽取2 ml-3 ml的血液注入血培養(yǎng)瓶中。另距回腸末端取下5 cm長度的一段回腸，其中1 cm用10%甲醛溶液浸泡，余下的回腸立即保存在-80℃冰箱內(nèi)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 組織學(xué)檢查 光鏡(100倍)下觀察腸黏膜形態(tài)，采用Chiu’s 6級評分法評價腸黏膜損傷程度:0分為正常;1分為絨毛頂端上皮下間隙增大;2分為上皮層和固有層中度分離;3分為絨毛兩側(cè)有大量分離伴有部分絨毛頂端破損;4分為絨毛破損伴有固有層毛細(xì)血管大量暴露;5分為固有層破壞、出血及潰瘍。

1.5.2 腸組織MPO活性 采用比色法測量腸組織內(nèi)的MPO活性，MPO活性大小主要反映組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞(PMN)數(shù)量，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.5.3 細(xì)菌移位 將抽取的1 ml血液立即注入血培養(yǎng)瓶中，利用 BACTEC9120全自動血培養(yǎng)儀和 Bacton Dickinson Bactec 9000軟件發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長的血培養(yǎng)瓶，然后再利用生物梅里埃APR鑒定系統(tǒng)鑒定細(xì)菌種類。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 對于定量數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組內(nèi)比較用t檢驗，組間比較用單因素方差分析;使用SPSS 13.0英文版統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)檢查 各組腸黏膜Chiu's評分比較無統(tǒng)計學(xué)意義，提示各灌胃組對腸道無損害作用。

2.2 腸組織MPO活性的比較 如表1所示:與LL1t組比較，HO2t組和PBS1t組的腸組織內(nèi)MPO活性較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與LL1t組比較，HO1t組和HO3t組的MPO活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);說明各灌胃組對腸道組織MPO的影響相似。

表 1 HO1t組、HO2t組、HO3t組、PBS1t組和LL1t組組腸組織MPO活性結(jié)果(x±s，MPO活力單位/克濕片)

2.3 細(xì)菌移位 HO1t組、PBS1t組和LL1t組血培養(yǎng)陰性，HO2t組有1例、HO3t組有2例血液細(xì)菌培養(yǎng)陽性，移位的細(xì)菌按出現(xiàn)次數(shù)依次為:大腸桿菌、木糖葡萄球菌、類白喉棒狀菌等。

3 討論

腸道功能的改變，首先表現(xiàn)為腸黏膜形態(tài)的變化，出現(xiàn)黏膜水腫和絨毛斷裂，發(fā)生腸黏膜屏障功能減退。通過Chiu's評分可以判斷出腸黏膜受損情況，是反映其功能改變的形態(tài)學(xué)指標(biāo)［11］。

在失血性休克期，腸道內(nèi)的正常菌群依賴腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖，細(xì)菌和(或)其釋放的內(nèi)毒素通過受損的腸黏膜屏障轉(zhuǎn)移到腸道外，這個過程稱之為細(xì)菌移位。細(xì)菌移位導(dǎo)致的炎癥介質(zhì)釋放，明顯比腸道因缺血缺氧刺激引起的炎癥介質(zhì)釋放要多［12］。炎癥介質(zhì)通過激活各種信號通路如激活NF-kB信號通路，導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)引起腸黏膜屏障功能的改變，甚者引起全身炎癥反應(yīng)綜合(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)［13］。

PMN作為人體主要的免疫細(xì)胞，發(fā)揮重要的免疫防御功能，擔(dān)負(fù)著吞噬消滅外來細(xì)菌、病毒及其他微生物的使命。正常情況下，腸道內(nèi)皮細(xì)胞通過細(xì)胞間連接和粘附功能，形成有效的腸黏膜屏障，使機體免于外界傷害因素的損害。而在病理情況下，大量活化的PMN通過偽足的機械作用和釋放各種氧化物質(zhì)(ROS)，造成腸黏膜屏障受損，發(fā)生腸黏膜水腫和腸黏膜屏障功能減退，這是腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要機制。而機體則分泌具有保護(hù)性機制的酶類［14］，如HO-1。HO-1的保護(hù)作用包括:抗炎癥反應(yīng)、抗凋亡、抗纖維化［15］，其保護(hù)機制與HO-1降解血紅素的代謝產(chǎn)物CO、膽綠素、膽紅素、鐵蛋白相關(guān)。

另外一些研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中HO-1的保護(hù)作用是有閾值的。HO-1適量表達(dá)，可以減少蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞死亡;表達(dá)量過高時，則會促進(jìn)乳酸脫氫酶的釋放和降低谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶含量，破壞細(xì)胞膜的完整性［16］。

本實驗室采用的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)是一種目前國際上高度通用、食品級的NICE系統(tǒng)(Nisin Controlled Expression system)，被廣泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表達(dá)［17］，這種食品級微生物能在腸道內(nèi)存活2～3 d，其本身不攻擊腸黏膜并且不引起強的免疫反應(yīng)［10］。通過外源性的補充腸道內(nèi)的乳酸乳球菌，可以將它攜帶的克隆基因帶到腸道內(nèi)，發(fā)揮藥理作用。

本研究條件下，各組Chiu's評分和MPO的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明腸黏膜屏障功能沒有發(fā)生明顯變化。HO2t組和HO3t組發(fā)生細(xì)菌移位，這可能與大量乳酸乳球菌在腸道內(nèi)形成的酸脅迫有關(guān)［18］，從而對局部細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生影響，包括破壞細(xì)胞膜，抑制多種酶和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的活性等［19］，但這種細(xì)菌移位的發(fā)生后果以及可能導(dǎo)致的并發(fā)癥，本研究沒有深入值得探討。因此，在如何提高乳酸工程菌體內(nèi)分泌重組HO-1的含量，同時不改變胃腸道微環(huán)境、破壞腸黏膜屏障等方面需要進(jìn)一步研究，使乳酸工程菌的基因治療達(dá)到一個理想的效果。

4 結(jié)論

本研究條件下，HO-1重組乳酸乳球菌對正常大鼠灌胃，不會隨著灌胃次數(shù)增加而影響腸黏膜屏障的功能。

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