劉長茹

結(jié)核病是一種較嚴(yán)重的傳染病，目前的疫情呈上升趨勢。檢出痰中含有結(jié)核桿菌是臨床診斷肺結(jié)核或鑒別肺結(jié)核與其他肺病的重要依據(jù)。痰中結(jié)核桿菌的檢測方法常規(guī)采用痰涂片及痰培養(yǎng)。涂片雖簡單易行，但陽性率低，培養(yǎng)雖為金標(biāo)準(zhǔn)，但周期太長，均難以滿足臨床需要。近年來，一些針對結(jié)核分支桿菌檢測的新方法陸續(xù)報(bào)道。本文對聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法、噬菌體裂解法、PCR-斑點(diǎn)雜交法，幾種結(jié)核分支桿菌檢測方法的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 檢測對象 肺結(jié)核組121例肺結(jié)核病住院患者(經(jīng)臨床確診)，其中痰菌涂片陽性者49例，涂陰者72例。非結(jié)核肺疾病組54例，他們中間慢阻肺者9例，上呼吸道感染者21例，肺炎20例，其他疾病4例。

1.2 檢測方法

1.2.1 PCR法 華美公司生產(chǎn)結(jié)核桿菌PCR檢測試劑盒(電泳法)，按說明進(jìn)行操作。

1.2.2 噬菌體裂解法

1.2.2.1 試劑 英國BIOTEC公司結(jié)核桿菌檢測試劑盒(FAST Plaque TBTM)。

1.2.2.2 方法 按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判定。

1.2.3 PCR-斑點(diǎn)雜交法 PCR法制備地高辛標(biāo)記的探針I(yè)NS-1(5'CGTGAGGGCATCGAGGTGGC)和INS-2(5'GCGTAGGCGTCGGTGACAAA)為引物，以BCG的DNA為模板，以dUTP-Dig:dTTP=3:1代替反應(yīng)體系中的 dTTP的量。(dUTP-Dig:Roche公司)，經(jīng) PCR擴(kuò)增，得到地高辛標(biāo)記的245bp 探針［1］。

標(biāo)本前處理，標(biāo)本加入1～2倍體積NoAc溶液，液化20 min，90℃水浴30 min，離心去上清，向沉淀中加入溶菌酶(promega公司)30 min，加入 SDS/蛋白酶 K 20 min。

取3 ul點(diǎn)膜，晾干;堿變性5 min，80℃烘干10 min;加入變性的探針進(jìn)行雜交，42℃ 3 h。雜交后洗膜加入anti-Dig-Ap(Roche公司)與探針上標(biāo)記的地高辛反應(yīng)。采用發(fā)光自顯影技術(shù)(CDP-star:Roche公司)檢測雜交帶。

痰標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)行標(biāo)記探針的雜交檢測。

2 結(jié)果

2.1 幾種檢測方法的敏感性實(shí)驗(yàn) 結(jié)核桿菌菌液分別配制不同濃度(Mcfarland 3.0濁度相當(dāng)于細(xì)菌濃度107cFu/ml)進(jìn)行四種方法檢測結(jié)核桿菌。PCR法、斑點(diǎn)雜交法、PCR-斑點(diǎn)雜交法、噬菌體裂解法檢出最低濃度分別為50、5×102、20、5×102cFu/m l。

2.2 PCR法對涂陽、涂陰、非結(jié)核病標(biāo)本的檢出率分別為89.8%、29.2%、1.9%;PCR-斑點(diǎn)雜交法的檢出率分別為98.0%、43.1%、1.9%;噬菌體裂解法的檢出率分別為93.9%、23.6%、0;PCR法、PCR-斑點(diǎn)雜交法、噬菌體裂解法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度分別為53.7%、38.8%、65.3%、52.1%，特異度分別為98.1%、100%、98.1%、100%。見表1

表1 四種方法檢測結(jié)核桿菌的結(jié)果

3 討論

對于肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷，涂片找抗酸桿菌還是最普及和經(jīng)濟(jì)的方法，但其陽性率很低(30%左右)。結(jié)核桿菌培養(yǎng)仍是目前診斷MTB的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性監(jiān)測等方面具有重要作用，但其耗時(shí)太長則有待改進(jìn)。

PCR法、PCR-斑點(diǎn)雜交法、噬菌體裂解法檢測結(jié)核桿菌其敏感性分別為40、20、3×102cFu/ml，檢測濃度均低于痰涂片的檢測濃度(5×103cFu/ml)。

PCR法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度為53.7%、特異度為98.1%。該方法具有敏感性高、診斷速度較快等優(yōu)點(diǎn)，但還存在一定程度的不穩(wěn)定性［2］。本文中出現(xiàn)一例假陽性，可能是標(biāo)本內(nèi)抑致物引起或標(biāo)本、試劑污染所致。PCR-斑點(diǎn)雜交法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度為65.3%、特異度98.1%，其靈敏度和敏感性均有待提高［3］。而特異性強(qiáng)的DNA探針雜交與敏感性高的PCR技術(shù)相結(jié)合已成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)研究、診斷應(yīng)用的一種良好途經(jīng)。

應(yīng)用噬菌體進(jìn)行結(jié)核菌的研究亦開始起步，通過實(shí)驗(yàn)得出噬菌體裂解法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度為52.1%、特異度為100%。該方法為結(jié)核菌的檢測和生、死菌的鑒別、特別是在結(jié)核菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)上的應(yīng)用開辟了一個(gè)新途徑［4］。

本文中介紹的幾種方法都具有較高的敏感性，對于結(jié)核病的診斷有較高靈敏度和特異度;隨著這幾種檢測方法的不斷成熟和完善、實(shí)驗(yàn)試劑的商業(yè)化、實(shí)驗(yàn)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化，這幾種方法有望成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷及鑒別診斷的有效方法之一。

［1］ 李書琳，韓中波，徐新順，等．吉林市結(jié)核分支桿菌IS6110 DNA指紋圖譜特征分析．中國防癆雜志，2002，24(6):313-316．

［2］ ShanKar P，Manjunath N，MohanK K，et al．Papid diagnosis of tuberculosis Meninigitis by polymerase chain reaction．The lancet，1991，237(4):5-7．

［3］ 張靈霞，莊玉輝，楊華衛(wèi)，等．rDNA探針雜交檢測病人痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌研究．中國防癆雜志，2000，22(3):127-129．

［4］ 劉志輝，羅一魯．結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷現(xiàn)狀及展望．中國防癆雜志，2003，25(1):38-40．