劉長茹
結(jié)核病是一種較嚴重的傳染病,目前的疫情呈上升趨勢。檢出痰中含有結(jié)核桿菌是臨床診斷肺結(jié)核或鑒別肺結(jié)核與其他肺病的重要依據(jù)。痰中結(jié)核桿菌的檢測方法常規(guī)采用痰涂片及痰培養(yǎng)。涂片雖簡單易行,但陽性率低,培養(yǎng)雖為金標準,但周期太長,均難以滿足臨床需要。近年來,一些針對結(jié)核分支桿菌檢測的新方法陸續(xù)報道。本文對聚合酶鏈反應(PCR)法、噬菌體裂解法、PCR-斑點雜交法,幾種結(jié)核分支桿菌檢測方法的應用進行評價。
1.1 檢測對象 肺結(jié)核組121例肺結(jié)核病住院患者(經(jīng)臨床確診),其中痰菌涂片陽性者49例,涂陰者72例。非結(jié)核肺疾病組54例,他們中間慢阻肺者9例,上呼吸道感染者21例,肺炎20例,其他疾病4例。
1.2 檢測方法
1.2.1 PCR法 華美公司生產(chǎn)結(jié)核桿菌PCR檢測試劑盒(電泳法),按說明進行操作。
1.2.2 噬菌體裂解法
1.2.2.1 試劑 英國BIOTEC公司結(jié)核桿菌檢測試劑盒(FAST Plaque TBTM)。
1.2.2.2 方法 按操作規(guī)程進行實驗及結(jié)果判定。
1.2.3 PCR-斑點雜交法 PCR法制備地高辛標記的探針I(yè)NS-1(5'CGTGAGGGCATCGAGGTGGC)和INS-2(5'GCGTAGGCGTCGGTGACAAA)為引物,以BCG的DNA為模板,以dUTP-Dig:dTTP=3:1代替反應體系中的 dTTP的量。(dUTP-Dig:Roche公司),經(jīng) PCR擴增,得到地高辛標記的245bp 探針[1]。
標本前處理,標本加入1~2倍體積NoAc溶液,液化20 min,90℃水浴30 min,離心去上清,向沉淀中加入溶菌酶(promega公司)30 min,加入 SDS/蛋白酶 K 20 min。
取3 ul點膜,晾干;堿變性5 min,80℃烘干10 min;加入變性的探針進行雜交,42℃ 3 h。雜交后洗膜加入anti-Dig-Ap(Roche公司)與探針上標記的地高辛反應。采用發(fā)光自顯影技術(CDP-star:Roche公司)檢測雜交帶。
痰標本經(jīng)PCR擴增后,用斑點雜交方法進行標記探針的雜交檢測。
2.1 幾種檢測方法的敏感性實驗 結(jié)核桿菌菌液分別配制不同濃度(Mcfarland 3.0濁度相當于細菌濃度107cFu/ml)進行四種方法檢測結(jié)核桿菌。PCR法、斑點雜交法、PCR-斑點雜交法、噬菌體裂解法檢出最低濃度分別為50、5×102、20、5×102cFu/m l。
2.2 PCR法對涂陽、涂陰、非結(jié)核病標本的檢出率分別為89.8%、29.2%、1.9%;PCR-斑點雜交法的檢出率分別為98.0%、43.1%、1.9%;噬菌體裂解法的檢出率分別為93.9%、23.6%、0;PCR法、PCR-斑點雜交法、噬菌體裂解法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度分別為53.7%、38.8%、65.3%、52.1%,特異度分別為98.1%、100%、98.1%、100%。見表1
表1 四種方法檢測結(jié)核桿菌的結(jié)果
對于肺結(jié)核的實驗室診斷,涂片找抗酸桿菌還是最普及和經(jīng)濟的方法,但其陽性率很低(30%左右)。結(jié)核桿菌培養(yǎng)仍是目前診斷MTB的金標準,尤其是藥敏實驗結(jié)果在指導臨床用藥及耐藥性監(jiān)測等方面具有重要作用,但其耗時太長則有待改進。
PCR法、PCR-斑點雜交法、噬菌體裂解法檢測結(jié)核桿菌其敏感性分別為40、20、3×102cFu/ml,檢測濃度均低于痰涂片的檢測濃度(5×103cFu/ml)。
PCR法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度為53.7%、特異度為98.1%。該方法具有敏感性高、診斷速度較快等優(yōu)點,但還存在一定程度的不穩(wěn)定性[2]。本文中出現(xiàn)一例假陽性,可能是標本內(nèi)抑致物引起或標本、試劑污染所致。PCR-斑點雜交法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度為65.3%、特異度98.1%,其靈敏度和敏感性均有待提高[3]。而特異性強的DNA探針雜交與敏感性高的PCR技術相結(jié)合已成為結(jié)核病實驗研究、診斷應用的一種良好途經(jīng)。
應用噬菌體進行結(jié)核菌的研究亦開始起步,通過實驗得出噬菌體裂解法檢測結(jié)核桿菌其靈敏度為52.1%、特異度為100%。該方法為結(jié)核菌的檢測和生、死菌的鑒別、特別是在結(jié)核菌藥物敏感性實驗上的應用開辟了一個新途徑[4]。
本文中介紹的幾種方法都具有較高的敏感性,對于結(jié)核病的診斷有較高靈敏度和特異度;隨著這幾種檢測方法的不斷成熟和完善、實驗試劑的商業(yè)化、實驗步驟的標準化,這幾種方法有望成為結(jié)核病實驗室診斷及鑒別診斷的有效方法之一。
[1] 李書琳,韓中波,徐新順,等.吉林市結(jié)核分支桿菌IS6110 DNA指紋圖譜特征分析.中國防癆雜志,2002,24(6):313-316.
[2] ShanKar P,Manjunath N,MohanK K,et al.Papid diagnosis of tuberculosis Meninigitis by polymerase chain reaction.The lancet,1991,237(4):5-7.
[3] 張靈霞,莊玉輝,楊華衛(wèi),等.rDNA探針雜交檢測病人痰標本中結(jié)核桿菌研究.中國防癆雜志,2000,22(3):127-129.
[4] 劉志輝,羅一魯.結(jié)核病實驗診斷現(xiàn)狀及展望.中國防癆雜志,2003,25(1):38-40.