劉 靜 韓冬梅 薛 梅 朱 玲 王志東 閆洪敏 郭子寬 王恒湘

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療頑固性潰瘍性結(jié)腸炎

劉 靜 韓冬梅 薛 梅 朱 玲 王志東 閆洪敏 郭子寬 王恒湘

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療頑固性潰瘍性結(jié)腸炎的療效。方法 對(duì)1例頑固性潰瘍性結(jié)腸炎患者采用臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注，每周1次，劑量為（1．5～1．8）×106cells/Kg，4周為一個(gè)療程，共兩個(gè)療程。流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)治療前后外周血免疫細(xì)胞的比例變化。結(jié)果 兩個(gè)療程后，患者腹痛及頑固性腹瀉消失，外周血中CD4＋/CD8＋細(xì)胞比例略有增加。結(jié)論 間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療潰瘍性結(jié)腸炎是安全的，這種新型療法可能是治療頑固性潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)合適選擇。

間充質(zhì)干細(xì)胞 潰瘍性結(jié)腸炎 輸注

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一類(lèi)反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病。確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是遺傳易感者在環(huán)境因素和腸道菌群作用下，免疫和炎癥反應(yīng)失調(diào)所致。氨基水楊酸類(lèi)藥物、皮質(zhì)激素、免疫抑制劑是目前治療潰瘍性結(jié)腸炎的主要方法，這些非特異性抗炎和免疫抑制藥物，只能暫時(shí)控制和緩解癥狀，不能從根本上治愈該病，且長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)增多，停藥后易復(fù)發(fā)（1年復(fù)發(fā)率大于50%）。部分對(duì)激素產(chǎn)生耐藥性的頑固性患者效果更差，嚴(yán)重危害健康。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)黏膜修復(fù)的功能[1]。我院率先采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注治療1例頑固性UC患者，療效較好。

1 病例資料

患者，男，25歲，2007年6月開(kāi)始，出現(xiàn)無(wú)明顯誘因的中上腹、左下腹隱痛不適，膿血便，2～3次/日，給予柳氮磺嘧啶，上述癥狀有所減輕。2008年7月，上述癥狀加重，頻繁膿血便，每日10余次，伴有劇烈腹痛，無(wú)發(fā)熱、惡心、嘔吐，再次就診，行腸鏡檢查示“全結(jié)腸黏膜彌漫性充血水腫，散在點(diǎn)片狀糜爛潰瘍”，診斷為潰瘍性結(jié)腸炎。給予5-氨基水楊酸、強(qiáng)的松等藥物治療，強(qiáng)的松最大量為60 mg/d，病情控制后減量至30 mg/d，但減量后病情反復(fù)。2009年3月，病情再次加重，癥狀同前，將強(qiáng)的松改為強(qiáng)的松龍，起始60 mg/d，癥狀控制后逐漸減至25 mg/d，但減量后病情亦反復(fù)。之后長(zhǎng)期給予強(qiáng)的松龍25 mg/d、5-氨基水楊酸4 g/d、硫唑嘌呤100 mg/d?；颊唛L(zhǎng)期腹痛，大便3次/日，膿血便，體重下降。2009年3月，2009年8月和2010年1月，結(jié)腸鏡檢查均提示“潰瘍性結(jié)腸炎（全結(jié)腸）”。2010年1月入我院，查體：消瘦，精神差，中上腹及左下腹部壓痛，腸鳴音亢進(jìn)，余未見(jiàn)異常。診斷：潰瘍性結(jié)腸炎（全結(jié)腸），活動(dòng)期，中度，慢性持續(xù)型。

2 治療方法

2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備

按文獻(xiàn)方法稍加改良后進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord MSC，UC-MSC）制備[2]。即，經(jīng)知情同意及感染源檢定后收集臍帶，去除外膜和動(dòng)靜脈，將臍帶剪成0．5 cm3大小組織塊，加入等體積0．2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化過(guò)夜。次日，加入兩倍體積的0．05%胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，計(jì)活細(xì)胞數(shù)。將細(xì)胞懸浮于hMSC無(wú)血清培養(yǎng)基（杭州百威公司）中，按1×106cells/cm2的密度接種于塑料培養(yǎng)瓶中。1周后出現(xiàn)由數(shù)十個(gè)形態(tài)類(lèi)似于成纖維細(xì)胞組成的集落。加入0．05%胰蛋白酶消化，按6 000 cells/cm2的密度接種細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。常規(guī)感染源檢定后，收集第3代細(xì)胞用于治療。

2.2 流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型分析

收集 MSC，分別加入 PE標(biāo)記的小鼠抗人PDGF-R、CD31、CD44、CD45和CD73單克隆抗體（BD公司，美國(guó)），室溫避光反應(yīng)20 min后，PBS洗滌。在治療前及治療1周后采集患者外周血，分別加入 PE或 FITC標(biāo)記的小鼠抗人 CD3、CD4、CD8、CD19、CD56以及Per-cep標(biāo)記的CD45單克隆抗體，反應(yīng)同前。BD Calibur（BD公司，美國(guó)）收集數(shù)據(jù)，WinMdi-2．9軟件分析結(jié)果。

2.3 細(xì)胞治療

采用靜脈輸注。首療程：UC-MSC 1．5×106cells/Kg每次（8×107個(gè)/次）；次療程：UC-MSC 1．8×106cells/Kg每次（1×108個(gè)/次）。每療程均治療4周，每周注射1次。

3 結(jié)果

3.1 UC-MSC的鑒定

收集MSC進(jìn)行表型分析，細(xì)胞均一表達(dá)CD73（間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記）、黏附分子CD44，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31和白細(xì)胞標(biāo)記CD45，符合MSC表型特征。三次細(xì)胞表型分析獲得近似結(jié)果（圖1）。

圖1 臍帶MSC表型特征Fig.1 The expression of CD31,CD44,CD45,CD73 in UC-MSCs

3.2 MSC治療效果觀察

2010年1月21日至2月11日，給予UC-MSC治療1療程，第一次輸注1周后患者腹痛減輕，大便次數(shù)減為2次/日，膿血便明顯減少；經(jīng)首療程治療，患者精神、食欲恢復(fù)正常，腹痛及腸鳴音亢進(jìn)消失，大便帶有少許膿血，1～2次/日。維持2個(gè)月后，腹瀉頻率增加，腹痛再次出現(xiàn)，膿血便4次/日。4月22日開(kāi)始應(yīng)用腫瘤壞死因子單抗治療 （隔周注射1次）。5月中旬大便次數(shù)減為2～3次/日，有少許膿血。6月大便為黃色成形軟便，1～2次/日。7月開(kāi)始出現(xiàn)膿血便，逐漸加重，最多10次/日。停用腫瘤壞死因子單抗，強(qiáng)的松龍?jiān)鰹?0 mg/d，繼續(xù)口服5-氨基水楊酸、硫唑嘌呤、整腸生、固腸止瀉丸，治療3月效果欠佳，膿血便8～10次/日，伴腹痛。2010年10月14日至11月4日，接受UC-MSC治療1療程，第一次治療后腹瀉次數(shù)減少為5次/日，腹痛較前明顯減輕，為腹部隱痛，食欲改善。第二次治療后腹瀉次數(shù)進(jìn)一步減少，2～3次/日，膿血便減少，腹痛較前減輕，強(qiáng)的松龍由60 mg/d逐漸減至50 mg/d。第三次治療后腹瀉消失。第四次治療后，大便1～2次/日，黃色成形便，便常規(guī)潛血陰性。停止治療1個(gè)月后，強(qiáng)的松龍減至30 mg/d，無(wú)明顯不適主訴，大便正常，體重由該次治療前的57 Kg增為60 Kg。治療期間及治療后無(wú)發(fā)熱等任何不良反應(yīng)記錄。

3.3 病人外周血免疫細(xì)胞比例的改變

治療前免疫細(xì)胞比例監(jiān)測(cè)：CD3陽(yáng)性細(xì)胞比例為83．1%，CD4為40．7%，CD8為38．2%，CD19（B淋巴細(xì)胞）為10．3%，CD56（NK細(xì)胞）為1．5%，Th/Ts= 1．07。治療后檢測(cè)：CD3陽(yáng)性細(xì)胞比例為90．4%，CD4為 51．3%，CD8為 37．6%，CD19（B淋巴細(xì)胞）為8．7%，CD56（NK細(xì)胞）為0．45%，Th/Ts=1．39，較治療前略有升高。

4 討論

UC是一種局限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層的炎癥過(guò)程，以結(jié)腸黏膜彌漫性損害（炎癥、糜爛、潰瘍等）為特點(diǎn)，主要癥狀有腹瀉、膿血便、腹痛和里急后重，病程漫長(zhǎng)，常反復(fù)發(fā)作。本病可見(jiàn)于任何年齡，20～30歲最多見(jiàn)。其發(fā)生可能與現(xiàn)代生活方式、基因遺傳、腸道菌群的免疫耐受缺失、免疫反應(yīng)激活等因素有關(guān)。目前的治療在于控制活動(dòng)性炎癥和調(diào)節(jié)免疫紊亂，包括抗炎藥物、激素、免疫抑制劑、生物治療等多種治療手段，但無(wú)一具有長(zhǎng)期療效且副作用頗多。頑固性UC指誘導(dǎo)或維持緩解治療失敗，通常為皮質(zhì)激素抵抗或依賴(lài)的病例。這些激素依賴(lài)或者抵抗的頑固性UC，病程遷延，局部和全身并發(fā)癥增多，重度UC死亡率仍較高，嚴(yán)重危害患者的健康，尋找有效的治療方法成為臨床研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。

MSC是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，來(lái)源廣泛，易于獲取，在適宜環(huán)境中能夠分化為內(nèi)、中、外胚層或神經(jīng)外胚層的細(xì)胞。一些研究顯示MSC擁有歸巢到損傷組織的能力，這與損傷部位炎性因子釋放增多，而MSCs表達(dá)某些炎性因子受體有關(guān)[1－2]。MSC在損傷部位通過(guò)分化為損傷細(xì)胞類(lèi)型，分泌適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子和生長(zhǎng)因子來(lái)參與組織的修復(fù)[3]。另外，MSC在體內(nèi)及體外擁有獨(dú)特的抑制免疫反應(yīng)的作用[3]，通過(guò)細(xì)胞間的接觸以及分泌可溶性抗炎因子，如腫瘤壞死因子拮抗劑等而發(fā)揮作用，可抑制T、B淋巴細(xì)胞的活化，降低樹(shù)突狀細(xì)胞抗原遞呈作用及其功能，從而可能調(diào)節(jié)腸道的炎性反應(yīng)[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將異基因鼠骨髓MSCs靜脈輸注給UC大鼠，MSC多歸巢于結(jié)腸病變部位，通過(guò)直接向腸系分化而使組織再生，并且在結(jié)腸部位炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β和環(huán)氧合酶-2（COX-2）明顯減少，而生長(zhǎng)因子b-FGF、HGF、VEGF明顯升高，通過(guò)抗炎及促修復(fù)雙重作用達(dá)到治療目的，使大鼠便血減輕，體重增加[5]。臨床上，MSC已用于治療除UC外的另外兩種炎性腸病，即克隆氏病及腸道移植物抗宿主病，均已進(jìn)入Ⅱ期或Ⅲ期臨床試驗(yàn)。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，將自體MSC局部注射入克隆氏病患者的9個(gè)瘺管中，8周后75%的瘺管愈合[6]。MSC治療激素耐藥的急性腸道移植物抗宿主病的Ⅱ期臨床研究顯示，55例患者接受HLA相合、半相合、完全不合供者的MSCs靜脈輸注，其中30例達(dá)到完全反應(yīng)，9例有改善，無(wú)副作用發(fā)生，且有效率與HLA匹配無(wú)關(guān)[7]。截止目前，MSC對(duì)UC的治療尚未見(jiàn)報(bào)道。

人臍帶華爾通膠含有豐富的MSC，在體外可大量擴(kuò)增，還可凍存，應(yīng)用前復(fù)蘇，短時(shí)間內(nèi)即可收獲足量的細(xì)胞用于臨床治療。Shetty等[8]比較骨髓、臍帶、臍血獲得的MSC，三種來(lái)源的MSC具有同樣的MSC表面分子表達(dá)：CD73＋、CD105＋、SSEA4＋、CD29＋、CD44＋和HLA ABC＋，而不表達(dá)與移植排斥相關(guān)的HLA DR，在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中能保持其多向分化潛能。在混合淋巴細(xì)胞檢測(cè)中呈免疫抑制，抑制T細(xì)胞增殖，異體移植該細(xì)胞可產(chǎn)生免疫耐受性[9]，表明其為一類(lèi)免疫原低下細(xì)胞，異基因移植不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。我們采用了臍帶來(lái)源的MSC治療。

本例患者診斷明確，發(fā)病時(shí)間3年，癥狀進(jìn)行性加重而無(wú)特效治療措施。經(jīng)靜脈注射MSC治療，使患者腹痛、腹瀉、膿血便消失。本文采用MSC輸注治療頑固性UC的方法安全有效。對(duì)于維持治療還需要隨訪和擴(kuò)大病例數(shù)，進(jìn)行更為嚴(yán)重深入的研究。

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Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Infusion for the Treatment of Refractory Ulcerative Colitis

LIU Jing1,HAN

Dongmei1,XUE Mei1,ZHU Ling1,WANG Zhidong1,YAN Hongmin1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1.1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute ofRadiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author:WANG Hengxiang (E-mail: wanghengxiang123@yahoo.com.cn).

Objective To investigate the safety and effectiveness of umbilical cord mesenchymal stem cells infusion in the treatment of ulcerative colitis．Methods A patient with ulcerative colitis received two cycles of mesenchymal stem cell infusion at a dose of(1．5-1．8)×106cells/Kg once a week for 4 consecutive weeks．The phenotypic characteristics of peripheral blood immune cells were analyzed before and one week after the treatment by FCM．Results The patient's abdominal pain disappeared and diarrhea was completely controlled．The ratio of CD4＋/CD8＋cells was slightly elevated after cell infusions．Conclusion Mesenchymal stem cell infusion for the treatment of ulcerative colitis is safe and effective．The novel regimen described here might be a suitable choice for the treatment of refractory ulcerative colitis．

Mesenchymal stem cells;Ulcerative colitis;Infusion

Q813．1＋2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月8日；

2011年7月28日）

10．3969/j．issn．1673-0364．2011．05．001

首都發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2007-2033），國(guó)家自然科學(xué)基金（30971068和30871018），軍隊(duì)臨床高新技術(shù)重大項(xiàng)目（2009）。

100142 北京市 北京空軍總醫(yī)院血液科 （劉靜，韓冬梅，薛梅，朱玲，王志東，閆洪敏，王恒湘）；100850 北京市 北京放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（郭子寬）。

王恒湘（E-mail：wanghengxiang123@yahoo．com．cn）。