連 鋒 薛 松 顧 萍 張谷蘭 吳學(xué)軍 朱洪生

低氧環(huán)境和血清饑餓對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞死亡率的影響

連 鋒 薛 松 顧 萍 張谷蘭 吳學(xué)軍 朱洪生

目的 探討低氧環(huán)境和血清饑餓對(duì)骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞死亡率的影響。方法 取SD大鼠骨髓，分離出內(nèi)皮祖細(xì)胞，并用免疫熒光法鑒定。取第2代細(xì)胞，分別在常氧環(huán)境（21%O2）合并正常血清（20%濃度）或血清饑餓（0%、2%濃度）條件下培養(yǎng)48 h，或是低氧環(huán)境（3%O2）合并正常血清或血清饑餓條件下培養(yǎng) 48 h、72 h、96 h、120 h。用Live/ Dead染色，結(jié)合圖像分析，計(jì)算細(xì)胞死亡率。結(jié)果 短期處于低氧環(huán)境中，內(nèi)皮祖細(xì)胞的死亡率無明顯變化（P＞0．05）。在血清饑餓條件下，細(xì)胞死亡率顯著升高（P＜0．01）。如果長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境中，與正常血清培養(yǎng)相比，血清饑餓培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞死亡率顯著升高（P＜0．01），72 h時(shí)達(dá)（96．30±3．18）%，120 h時(shí)達(dá)100%。結(jié)論 缺氧環(huán)境和血清饑餓對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的存活均有不良影響，其中血清饑餓的影響更大。

內(nèi)皮祖細(xì)胞 血清饑餓 缺氧 死亡率

內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cell，EPCs）參與血管建立的兩個(gè)過程：血管發(fā)生（Vasculogenesis）和血管生成(Angiogenesis)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，EPCs移植到缺血心肌后，能改善心功能，因此有望用于缺血性心臟病的干細(xì)胞治療[3-4]。目前主要的技術(shù)瓶頸是，移植后不久EPCs即大量死亡，有研究表明，短期內(nèi)絕大多數(shù)移植于缺血心肌的干細(xì)胞死亡，導(dǎo)致移植效果不夠理想[5-6]，我們考慮這可能與病變局部缺血和缺氧有關(guān)。為驗(yàn)證這一設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)在低氧和血清饑餓環(huán)境中培養(yǎng)EPCs，并比較不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞死亡率。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，6～8月齡，體質(zhì)量300～350 g（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

戊巴比妥鈉 （上海化學(xué)試劑公司）；IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))；胎牛血清（Invitrogen,美國(guó)）；0．25%胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，Sigma，美國(guó)）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，Sigma，美國(guó)）；淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)科學(xué)院生物工程研究所）；纖維粘連蛋白 （FN，Sigma，美國(guó)）；兔抗鼠 CD31抗體（Santa cruz，美國(guó)）；兔抗鼠CD34抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗鼠Flk-1抗體（Santa cruz，美國(guó)）；兔抗鼠vWF抗體（DAKO，丹麥）；激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，德國(guó) ），Live/Dead viability/cytotoxicity kit（Molecular Probes，美國(guó)）。

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液含有低糖 IMDM，胎牛血清（FBS），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF）30 μL/mL和bFGF 10 μL/mL。

1.3 EPCs的分離、培養(yǎng)

1%的戊巴比妥鈉（30 mg/Kg）腹腔內(nèi)注射麻醉SD大鼠。大鼠仰臥位，固定在手術(shù)臺(tái)上，下肢備皮消毒。逐層切開皮膚、肌肉，暴露股骨，剪開股骨兩端，用含肝素4 000 IU的生理鹽水10 mL反復(fù)沖洗骨髓腔，所得骨髓液用IMDM稀釋備用。

采用密度梯度離心法，淋巴細(xì)胞分離液密度1．088，2 000 r/min離心25 min，然后用毛細(xì)吸管吸取中間云霧層（即單核細(xì)胞層）。置入另一離心管，加入5倍體積的IMDM洗滌2次，每次1 300 r/min離心5 min，棄上清，加入IMDM重懸細(xì)胞。以1×106cell/mL的濃度接種到涂有FN的培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。3 d后更換培養(yǎng)液，同時(shí)棄去未貼壁的細(xì)胞，此后每隔3天換液。10 d左右，待貼壁細(xì)胞幾乎完全鋪滿培養(yǎng)皿底，用0．25%胰蛋白酶消化、傳代。

1．4 EPCs的鑒定

取第2代EPCs以1×104cells/mL濃度接種到32 mm培養(yǎng)皿（內(nèi)置玻片）。培養(yǎng)7 d后用免疫熒光染色法鑒定內(nèi)皮標(biāo)志物CD31、CD34、Flk-1和vWF。操作步驟如下：加入40 g/L的多聚甲醛，在4℃下固定20 min,PBS洗滌3次；0．01%Triton-X 100孵育3 min，PBS洗滌3次；滴加3%雙氧水，室溫下孵育10 min，PBS洗滌3次；滴加50 g/L牛血清白蛋白（BSA），室溫下封閉60 min。在不同的玻片上，分別滴加兔抗鼠CD31抗體、兔抗鼠CD34抗體、兔抗鼠Flk21抗體和兔抗鼠vWF抗體，均以1∶200的比例稀釋，4℃下過夜。PBS洗滌3次，每次5 min，然后分別滴加1∶100山羊抗兔IgG2FITC，37℃下孵育2 h，再用PBS洗滌3次，每次5 min。用甘油PBS封片后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察、記錄。對(duì)照玻片，加一抗時(shí)用PBS替代，作為陰性對(duì)照。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組和處理

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第2代EPCs，分別在常氧環(huán)境（21%O2）合并正常血清（含20%FBS）或血清饑餓（含0%、2%FBS）條件下培養(yǎng)48 h，或是低氧環(huán)境（3%O2）合并正常血清或血清饑餓條件下培養(yǎng) 48 h、72 h、96 h、120 h。每組設(shè)3孔。

1.6 細(xì)胞死亡率測(cè)定

參照試劑盒說明書，分別測(cè)定各組EPCs的死亡率。鈣黃綠素AM（Calcein AM）與活細(xì)胞的膜結(jié)合，發(fā)綠色熒光；而溴乙非啶同型二聚體（Ethidium homodimer，EthD-1）與受損細(xì)胞的核酸結(jié)合，發(fā)紅色熒光。用Leica QWIN圖像處理及分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，紅色細(xì)胞百分比即為細(xì)胞死亡率。每份標(biāo)本重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 10．0軟件進(jìn)行方差分析，Bonferroni法進(jìn)行組間比較。P＜0．05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01提示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定

免疫熒光染色結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞 CD31、CD34、Flk-1和vWF染色陽(yáng)性，7 d時(shí)90%的貼壁細(xì)胞能攝取Dil-LDL（圖1～4）。

2.2 低氧環(huán)境和血清饑餓對(duì)大鼠EPCs死亡率的影響

在常氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，2%和0%FBS之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），但上述兩組和20%FBS組死亡率相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。在低氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，20%FBS組的細(xì)胞死亡率明顯高于0%和2%FBS組（P＜0．01)，而2%和0%FBS之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。采用相同濃度的血清培養(yǎng)EPCs，低氧組和常氧組的細(xì)胞死亡率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）（表1）。與短期低氧（48 h）相比，長(zhǎng)期低氧（72 h、96 h、120 h）時(shí)血清饑餓組EPCs的死亡率顯著升高（P＜0．01），但這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。在各時(shí)間點(diǎn)，0%FBS組和2%FBS組的細(xì)胞死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），但是這兩組與20%FBS組相比，細(xì)胞死亡率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。20%FBS組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）（表2）。

圖1 第2代細(xì)胞培養(yǎng)3天時(shí)的CD31表達(dá)（100×，標(biāo)尺50 μm）Fig.1 CD31 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

圖2 第2代細(xì)胞培養(yǎng)3天時(shí)的CD34表達(dá)（100×，標(biāo)尺50 μm）Fig.2 CD34 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

圖3 第2代細(xì)胞培養(yǎng)3天時(shí)的flk-1表達(dá)（100×，標(biāo)尺50 μm）Fig.3 Flk-1 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday(100×,bar 50 μm)

圖4 第2代細(xì)胞培養(yǎng)3天時(shí)的vWF表達(dá)（100×，標(biāo)尺50 μm）Fig.4 vWF expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

表1 常氧、低氧環(huán)境和不同濃度FBS對(duì)EPCs死亡率的影響（x±s）Table 1 The effect of Normal,low oxygen and different FBS concentration on EPCs mortality(x±s)

表2 在低氧環(huán)境中，采用不同血清濃度培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)EPCs死亡率的比較（x±s）Table 2 Comparison of EPCs mortality with different serum concentration and culture time under low oxygen(x±s)

3 討論

在缺血性心臟病的干細(xì)胞移植治療領(lǐng)域，如何提高移植細(xì)胞的生存率一直是個(gè)難題。EPCs治療缺血性心臟病時(shí)，需先在常氧（21%O2）、高血清（20% FBS）環(huán)境下進(jìn)行擴(kuò)增，然后制備細(xì)胞懸液用于移植。據(jù)報(bào)道，移植后1 h內(nèi)移植細(xì)胞的存活率只有58%[7]；而在移植后24 h，只有1%的移植細(xì)胞存活[8]，具體原因和機(jī)制不明。因缺血性心臟病的基本病理要素是缺氧和缺血[9－10]，我們?cè)O(shè)想移植細(xì)胞的死亡主要與這兩種因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在常氧環(huán)境中，血清饑餓會(huì)明顯增加EPCs的死亡率。血清中含有一些生存所需的因子，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等。以往已經(jīng)證實(shí)，EPCs的培養(yǎng)需要血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的參與，而血清饑餓組僅含少量或不含有生長(zhǎng)因子，影響了EPCs的存活。另一方面，短期低氧對(duì)EPCs的死亡率沒有明顯影響。這可能是因?yàn)?，骨髓中特別是骨內(nèi)膜（亦稱骨髓膜，為襯墊于骨髓腔內(nèi)、富含血管的結(jié)締組織層，其結(jié)構(gòu)與骨膜內(nèi)層相似，也有造骨功能，骨內(nèi)膜在X線檢查中不能顯示）中的氧濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于組織平均氧濃度[11]，造血干細(xì)胞對(duì)于缺氧環(huán)境比較適應(yīng)。有研究表明，在體外低氧環(huán)境中培養(yǎng)造血干細(xì)胞，并不影響其自我更新[12]。據(jù)此我們認(rèn)為，與低氧相比，血清饑餓對(duì)細(xì)胞存活的影響更大。

缺血組織的血管再生是一個(gè)長(zhǎng)期、緩慢的過程，因此我們還觀察了長(zhǎng)期低氧對(duì)細(xì)胞死亡率的影響。結(jié)果顯示，隨低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，血清饑餓組的細(xì)胞死亡率急劇上升，72 h即達(dá)到96.3%，120 h達(dá)100%；20%FBS組的細(xì)胞死亡率也有所升高，但是明顯低于血清饑餓組。這也證實(shí)了血清的細(xì)胞保護(hù)作用，此外還提示，長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境中，即使有營(yíng)養(yǎng)因子，細(xì)胞存活率也會(huì)受到明顯影響。

從理論上講，2%的FBS含有少量營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，對(duì)干細(xì)胞的生存率應(yīng)該有所幫助[13]。但是，我們觀察到，無論在常氧還是低氧環(huán)境中，0%FBS和2% FBS組的EPCs死亡率都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？赡軐?duì)于EPCs來說，2%的FBS提供的營(yíng)養(yǎng)因子遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以滿足細(xì)胞的生存需要。

總之，血清饑餓和長(zhǎng)期缺氧都不利于EPCs的體外生存，其中以血清饑餓的影響更大。在EPCs移植治療缺血性心臟病時(shí)，須注意解除缺血因素，減少局部組織缺氧時(shí)間，以提高移植細(xì)胞的生存率。

[1] Hung HS,Shyu WC,Tsai CH,et al.Transplantation of endothelial progenitor cells as therapeutics for cardiovascular diseases[J]. Cell Transplant,2009,18(9):1003-1012.

[2] Ding YT,Kumar S,Yu DC.The role of endothelial progenitor cells in tumour vasculogenesis[J].Pathobiology,2008,75(5):265-273.

[3] Rodriguez-Losada N,Garcia-Pinilla JM,Jimenez-Navarro MF,et al.Endothelial progenitor cells in cell-based therapy for cardiovascular disease[J].Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2008,54(1): 11-23.

[4] Jujo K,Ii M,Losordo DW.Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium[J].J Mol Cell Cardiol, 2008,45(4):530-544.

[5] Cho HJ,Lee N,Lee JY,et al.Role of host tissues for sustained humoral effects after endothelial progenitor cell transplantation into the ischemic heart[J].J Exp Med,2007,204(13):3257-3269.

[6] Tang YL,Tang Y,Zhang YC,et al.Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated heme oxygenase-1 vector[J].J Am Cell Cardiol,2005,46(7):1339-1350.

[7] Muller-Ehmsen J,Whittaker P,Kloner RA,et al.Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium[J].J Mol Cell Cardiol,2002,34(2):107-116.

[8] Toma C,Pittenger MF,Cahill KS,et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart[J].Circulation,2002,105(1):93-98.

[9] Bonavita F,Stefanelli C,Giordano E,et al.H9c2 cardiac myoblasts undergo apoptosis in a model of ischemia consisting of serum deprivation and hypoxia:Inhibition by PMA[J].FEBS Lett,2003, 536(1-3):85-91.

[10] Chao W,Shen Y,Li L,et al.Importance of FADD signaling in serum deprivation-and hypoxia-induced cardiomyocyte apoptosis [J].J Biol Chem,2002,277(35):31639-31645.

[11] Li Z,Li L.Understanding hematopoietic stem-cell microenvironments[J].Trends Biochem.Science,2006,31(10):589-595.

[12] Csete M.Oxygen in the cultivation of stem cells[J].Ann NY Acad Sci,2005(5),1049:1-8.

[13] Potier E,Ferreira E,Meunier A,et al.Prolonged hypoxia concomitant with serum deprivation induces massive human mesenchymal stem cell death[J].Tissue Eng,2007,13(6):1325-1331.

Effects of Low Oxygen and Serum Deprivation on Death Rate of Endothelial Progenitor Cells

LIAN Feng1,XUE

Song1,GU Ping2,ZHANG Gulan1,WU Xuejun1,ZHU Hongsheng1.1 Department of Cardiothoracic Surgery,Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China;2 Laboratory Diagnostic Center,Shanghai Children's Medical Center,Shanghai 200127,China.Corresponding author:ZHU Hongsheng(E-mail:zhuhs@sohu.com).

Objective To explore the effects of low oxygen and serum deprivation (SD)on death rate of bone marrowderived Endothelial Progenitor Cells(EPCs)．Methods EPCs were isolated from bone marrow of Sprague-Dawley(SD)rats and identified by immunofluorescence assay．Passage 2 EPCs were exposed to normal oxygen(21%O2)and 0%,2%,or 20% fetus bovine serum(FBS)for 48 hours,or low oxygen(3%O2)and 0%,2%,or 20%FBS for 48,72,96,and 120 hours．Cell death rate was calculated by Live/Dead staining and image analysis．Results Cell death rate was not affected by low oxygen for 48 hours(P＞0．05),but affected greatly by serum deprivation(P＜0．01)．In a low-oxygen environment for longer hours,cells exposed to serum deprivation(0%,2%FBS)showed much higher death rate,as compared with cells exposed to 20%FBS (P＜0．01)．The death rate reached (96．30±3．18)%for 72 hours and 100%for 120 hours．Conclusion Survival of EPCs is affected by both low oxygen and serum deprivation,of which serum deprivation plays a more dominant role．

Endothelial progenitor cells; Serum deprivation; Low oxygen; Death rate

Q813．1＋2

A

1673-0364（2011）04-0181-05

2011年6月14日；

2011年7月7日）

10．3969/j．issn．1673-0364．2011．05．001

國(guó)家自然科學(xué)基金（30170930），上海市自然科學(xué)基金（044119715，08ZR1413600）。

200127 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院心胸外科（連鋒，薛松， 張谷蘭，吳學(xué)軍，朱洪生）；200127 上海市 上海兒童醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)診斷中心（顧萍）。

朱洪生（E-mail：zhuhs@sohu．com）