王 健 劉 霞 肖 苒 曹誼林

·論著·

應用細胞膜片復合硅膠管內支撐構建組織工程管狀軟骨

王 健 劉 霞 肖 苒 曹誼林

目的 研究利用羊耳軟骨細胞形成細胞膜片，構建無細胞支架組織工程管狀軟骨的可行性。方法 體外培養(yǎng)擴增羊耳軟骨細胞至第2代，以2.0×106cells/mL的高密度，培養(yǎng)7 d，形成直徑為35 mm的圓形細胞膜片，將細胞膜片均勻包裹于硅膠管，植入裸鼠背部皮下，4周后取材檢測。以大體觀察、組織學、免疫組織化學等方法，對形成的軟骨進行評價。結果 大體觀察可見形成良好的管狀軟骨，HE染色見軟骨陷窩形態(tài)規(guī)則，番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組化均呈陽性表達。結論 細胞膜片復合硅膠管內支撐的方法能形成管狀軟骨，為氣管軟骨的再造提供了新的方法。

無細胞支架 細胞膜片 管狀軟骨 氣管軟骨

因腫瘤、外傷、先天畸形等導致的氣管缺損，臨床上至今沒有理想的修復方法。目前，修復氣管缺損常用的手段是端端吻合。但缺損過長時，需采用自體移植[1-3]、異體移植[4]、人工材料[5－6]等方法進行修復，這些方法均存在不同的局限性。軟骨組織工程技術的研究進展，為氣管構建及修復提供了新思路[7－8]。

以往的研究多采用軟骨細胞接種支架材料 （如PGA等），在動物體內構建環(huán)狀或管狀軟骨[7，9]。但支架材料降解時間長，需要在體外培養(yǎng)較長時間，未完全降解的支架材料容易引起炎癥反應，從而影響特定形狀的組織工程化軟骨的形成[9-12]。因此，我們嘗試單純應用細胞膜片，不用細胞支架的方式構建管狀軟骨，以避免材料降解產物對軟骨形成的不良影響，并縮短體外培養(yǎng)時間。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康山羊3只，6月齡，體質量25 Kg，雌雄不限（中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院動物中心）。

1.2 羊耳軟骨細胞分離、培養(yǎng)與擴增

取羊耳軟骨，將其剪成2 mm×2 mm×2 mm大小，PBS沖洗3遍，以0．25%胰蛋白酶（含EDTA）在37℃搖床中預消化30 min，以消除軟骨表面殘余軟組織。PBS沖洗3遍，以4倍體積的0．2%Ⅱ型膠原酶37℃搖床內消化10～12 h，200目濾網過濾，2 000 r/min離心8 min，去上清后加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，計數(shù)后以1×104cells/cm2的細胞濃度接種培養(yǎng)皿，在37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)液。待細胞生長近80%匯合后，以0．25%胰蛋白酶（含EDTA）消化并傳代培養(yǎng)，仍以1×104cells/cm2細胞密度傳代，傳至第2代，收集備用（圖1A）。

1.3 羊耳軟骨細胞培養(yǎng)形成細胞膜片

將收集的羊耳軟骨細胞以2×106cells/mL密度接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，7 d后薄膜狀細胞膜片形成（圖1B）。

1.4 細胞膜片包裹于硅膠管外構建管狀復合體

內支撐的硅膠管長1 cm，外徑8 mm，管壁打孔，高壓消毒后備用（圖1C）。然后將體外構建的細胞膜片包裹于硅膠管外，形成管狀復合體（圖2A）。

1.5 植入、取材及相關檢測

將管狀復合體植入裸鼠皮下培養(yǎng)4周后取材，行大體標本觀察，并以4%多聚甲醛固定24 h、脫水、石蠟包埋、切片，HE染色、番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫組化進行組織學觀察。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)及細胞膜片觀察

原代軟骨細胞接種12～24 h后貼壁，由圓形逐漸伸展呈橢圓形、三角形和多角形，形成獨立的同源細胞群，隨后細胞群落逐漸擴展匯合。傳代后，軟骨細胞大多呈多角形或梭形，一般5～7 d可達80%以上匯合。

第2代軟骨細胞經高密度接種培養(yǎng)1周后，形成具有一定厚度的細胞膜片，呈乳白半透明狀，有光澤和彈性，可以用鑷子簡單地夾起，并折疊和卷曲，可操作性良好。

2.2 大體及組織學觀察結果

將細胞膜片包裹于硅膠管后，植入裸鼠皮下培養(yǎng)4周，取材時可見管狀軟骨樣組織形成（圖2B），長度1 cm，直徑8 mm，顏色呈乳白色，有光澤，質地均勻、中等偏硬，彈性好，能夠維持管狀外形，觸之不會塌陷，可以用器械夾持操作。HE染色可見軟骨樣細胞均勻分布，呈卵圓形，偶見多角形，陷窩結構清晰，細胞位于陷窩之中，周圍是較均勻的細胞外基質；番紅O染色可見細胞外基質著色為鮮紅色，提示GAG聚合蛋白多糖含量豐富，有大量軟骨基質物產生；Ⅱ型膠原免疫組化結果陽性，提示有豐富的膠原沉積（圖3）。

圖1 細胞膜片及植入體構建Fig.1 Chondrocyte sheet and implant

圖2 細胞膜片包裹硅膠管體內構建管狀軟骨Fig.2 Construction of cylindrical cartilage combined with cell sheet and silicon tube

圖3 組織學檢測（100×）Fig.3 Histological observation(100×)

3 討論

組織工程管狀軟骨的構建策略多為先將支架材料預制成管狀，再將細胞懸液接種到多孔的支架材料上，并在動物體內形成軟骨。但是，應用支架材料主要存在兩個問題，一是細胞接種效率比較低，由于液體的流動性，很多細胞在接種時容易丟失，細胞分布也不均勻，這對構建特定形態(tài)的組織是不利的[13]；二是植入機體后容易引起炎性反應，生物相容性好且可降解的支架材料，在構建特定形態(tài)、體積較大的軟骨時，常存在強度差、降解速度太快、降解產物影響細胞生長等問題，機體對材料的免疫排斥反應也影響著軟骨組織的形成[14]。

本實驗中，我們采用細胞膜片的方式防止細胞流失，提高細胞利用率，而且避免了材料降解產物對組織形成的影響。所形成的膜片其內部細胞分布均勻，細胞被自身分泌的基質相互連接為整體，類似軟骨組織。我們進一步以硅膠管作為內支撐，將膜片包裹后直接植入裸鼠皮下，減少了體外培養(yǎng)時間，而且避免了支架材料引起的免疫反應，構建出管狀軟骨組織。所形成組織質地均勻，形態(tài)維持好，具有一定彈性，證實我們采用的無細胞支架的細胞膜片技術，在體內構建具有精確形態(tài)和良好機械強度的管狀軟骨移植體是完全可行的。本實驗所采用的這種構建方法，也為其他特定形態(tài)組織的構建提供了方法學參考。

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《組織工程與重建外科》雜志2012年征稿、征訂通知

《組織工程與重建外科》雜志（Journal of Tissue Engineering and Reconstructive Surgery)是由上海交通大學主管、上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院主辦的綜合性醫(yī)學學術期刊，國內統(tǒng)一連續(xù)出版物號：CN 31-1946/R，標準刊號：ISSN 1673-0364。

本刊由中國工程院院士張滌生教授擔任名譽主編，中華醫(yī)學會整形外科分會主任委員、中國生物醫(yī)學工程學會組織工程分會主任委員曹誼林教授擔任主編。本刊是組織工程學和整形重建外科的專業(yè)學術期刊，報道組織工程及其相關領域、美容外科、顱面外科、眼科、口腔頜面外科、四肢顯微外科、骨科的臨床及基礎研究成果，并及時介紹整形重建外科重大進展、新技術和新動態(tài)，力求科學性、實用性。本編輯部誠征上述相關研究領域文章，歡迎各位專家、學者賜稿。歡迎廣大醫(yī)務人員、科研工作者、相關研究院所、醫(yī)院圖書館、高等院校圖書館訂閱。

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《組織工程與重建外科》雜志編輯部

Construction of Scaffold-free Cylindrical Cartilage Combined with Cell Sheet and Silicon Tube

WANG Jian,LIU Xia,XIAO Ran,CAO Yilin.Research Center of Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.Corresponding author:LIU Xia(E-mail:Lacey2003@tom.com),Cao Yilin(E-mail: yilincao@yahoo.com).

Objective To explore the feasibility of fabricating a scaffold-free cylindrical cartilage using cell sheet with silicon tube as interior support in vivo.Methods Auricular chondrocytes were harvested from goat and the second passage of auricular chondrocytes were cultivated with high-density of 2.0×106cells/mL to form a chondrocyte sheet with the diameter of 35 mm.Then the silicon tube covered with cell sheet was implanted into the back of nude mice.The tissue engineered cylindrical cartilages were evaluated by gross observation,histological and immunohistochemical examination.Results The cartilage was sufficiently elastic and stiff to maintain the structure without disruption. Cartilage tissue was observed by HE staining,Safranin O staining and immunohistochemical staining for typeⅡ collagen.Conclusion A novel technique was developed for fabricating engineered cylindrical cartilage using cell sheet with silicon tube in vivo.

Scaffold-free;Cell sheet;Cylindrical cartilage;Tracheal cartilage

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年8月3日；

2011年8月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

北京市科委科技計劃重大項目資助（D090800046609003），衛(wèi)生部部屬醫(yī)院臨床學科重點項目,國家自然科學基金青年科學基金項目 （30801192），北京市自然科學基金（7102134），高等學校博士學科點專項科研基金（新教師基金課題，200800231078）。

100144 北京市 北京協(xié)和醫(yī)學院，中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院研究中心。

曹誼林（E-mail:yilincao@yahoo.com），劉霞（E-mail: Lacey2003@tom.com）。