夏偉強(qiáng)，周源，石明

1 北京航空航天大學(xué) 儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院，北京，100191

2 河北承德實(shí)驗(yàn)中學(xué)，河北，承德，167101

雙光子顯微成像技術(shù)的新進(jìn)展

【作 者】

夏偉強(qiáng)1，周源2＊，石明2

1 北京航空航天大學(xué) 儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院，北京，100191

2 河北承德實(shí)驗(yàn)中學(xué)，河北，承德，167101

雙光子顯微成像技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型非線性光學(xué)成像方法,由于其優(yōu)異的特性已廣泛用于細(xì)胞生物活細(xì)胞、組織的長時(shí)間動(dòng)態(tài)三維成像。文中首先介紹了雙光子成像的原理和特點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上總結(jié)了雙光子顯微成像技術(shù)的研究熱點(diǎn)；其次并分別就如何獲得更低的細(xì)胞損害、更快的圖像獲取速度和更高的成像靈敏度三個(gè)方面作了論述；最后展望了雙光子顯微成像技術(shù)的發(fā)展前景。

雙光子；全內(nèi)反射；活細(xì)胞成像；三維成像；光致漂白

0 引言

1990年，Denk等將雙光子激發(fā)用于熒光激發(fā)系統(tǒng)，制造出了世界上第一臺(tái)雙光子掃描顯微鏡，并應(yīng)用于生物學(xué)觀測[1]。1997年，美國伯樂公司首次制造出商業(yè)化的雙光子顯微鏡。雙光子激光掃描顯微鏡一經(jīng)問世，由于其低細(xì)胞損傷，大成像深度和可用于活細(xì)胞長時(shí)間三維成像，很快被用于神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)、生物代謝過程以及藥物研究[2]。從此，熒光標(biāo)記技術(shù)和光學(xué)顯微鏡技術(shù)的結(jié)合，使觀察和研究活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生命過程成為很普通的事情[3-6]。

近年來，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)逐漸成為細(xì)胞生物學(xué)的研究重點(diǎn)，而細(xì)胞中Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要的作用。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)，可以無損地觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2+圖像隨時(shí)間和空間的變化，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的Ca2+熒光圖像和變化。此有助于研究者更深人的研究和了解鈣離子在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過程和生物調(diào)控機(jī)制，弄清各信號(hào)系統(tǒng)之間的相互關(guān)系，找出細(xì)胞內(nèi)不同類型Ca2+是否能引起不同基因表達(dá)的原因，從而幫助生物學(xué)家及生理學(xué)家總結(jié)出Ca2+作為胞內(nèi)第二信使在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的規(guī)律[7-9]。

雙光子熒光成像技術(shù)，采用長波激發(fā)，能對組織深層次成像，且許多常用最佳激發(fā)波長位于800-900 nm，水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對這個(gè)波段的光吸收低，還有散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景和光損傷小，所以適用于在體檢測[10-11]。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確確定細(xì)胞內(nèi)微電極的位置，能夠探測到胞體、樹突甚至單個(gè)樹突棘的活性。Mainen[12]用雙光子顯微鏡觀察了完整神經(jīng)組織的高分辨熒光圖像,可看到腦組織神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹突棘中的鈣分布。Eilers[13]用這一技術(shù)研究了神經(jīng)元樹突的信號(hào)整合。Masters[14]用雙光子顯微鏡原位測量了人皮膚中NAD( P) H的自發(fā)熒光,以觀察皮膚的代謝情況。

近些年，隨著光學(xué)技術(shù)、熒光探針技術(shù)以及生物技術(shù)[15]的發(fā)展，雙光子成像技術(shù)出現(xiàn)了新的特點(diǎn)和新的應(yīng)用，大大推動(dòng)了其在活體細(xì)胞及組織成像的應(yīng)用。

1 雙光子成像特點(diǎn)

雙光子成像技術(shù)與傳統(tǒng)的單光子成像相比有很多優(yōu)點(diǎn)。可用單光子、雙光子和二次諧波光子激發(fā)熒光的Jabonski能級(jí)示意圖(圖1)比較來說明熒光成像原理[16][17][18][19]。

圖 1 光子激發(fā)熒光的Jablonski能級(jí)圖比較Fig.1 Comparison of Jablonski Diagram of Two-photon Excitation

在圖1中，S0、S1、S2表示光子能級(jí)，λ1、λ2、λ3是光子波長。其中，單光子顯微鏡(One-photon microscopy)，在短波長光波(紫外光或紫藍(lán)色光，其中λ1波長250～400nm)照射下，某些物質(zhì)吸收光能，一個(gè)熒光團(tuán)吸收一個(gè)光子，受到激發(fā)并釋放出一種能量降級(jí)的較長的光波(藍(lán)、綠、黃或紅光，波長400～800 nm，＞λ1)，實(shí)現(xiàn)成像。單光子顯微技術(shù)是最成熟的熒光顯微技術(shù)[20]，實(shí)現(xiàn)容易，結(jié)構(gòu)簡單，對成像硬件要求低。但由于此技術(shù)使用的激發(fā)光能量較大，會(huì)造成對熒光物質(zhì)的漂白作用，光毒性嚴(yán)重，且由于激發(fā)波長較短，成像深度有限。當(dāng)采用激光共焦掃描顯微鏡(圖 2)時(shí)，由于共焦顯微鏡的孔徑很小，實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描，成像速度慢，對樣本損害大，很難用于長時(shí)間活細(xì)胞成像。當(dāng)采用寬場顯微鏡時(shí)，能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像，光漂白小，因而在活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測中應(yīng)用較早。但寬場顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾，難于實(shí)現(xiàn)多維成像(圖 3)。

圖 2 共聚焦激光掃描顯微術(shù)(LSCM)與雙光子激發(fā)激光掃描顯微術(shù)(TPELSM)Fig.2 Comparison of Confocal(LSCM) and Two-photon Microscope(TPELSM)

圖 3 單光子和雙光子成像特點(diǎn)Fig.3 Comparison of characteristics of one-photon excitation and two-photon excitation

雙光子顯微鏡（Two-photon microscopy），是結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)[17-19](如圖2)。它用fs(飛秒)激光器作為激發(fā)光源，利用極高的光子密度實(shí)現(xiàn)多光子非線性激發(fā)，即熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)長波長的光子到激發(fā)態(tài)（如圖 1中λ2）， 在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長大于激發(fā)光波長一半的較短的光子，從而實(shí)現(xiàn)成像。多光子激發(fā)為非線性過程，其吸收截面(躍遷幾率)較小，并與激發(fā)光光強(qiáng)的n次方成正比(n為熒光分子一次吸收的激發(fā)光光子數(shù))，因此多光子激發(fā)只有在焦點(diǎn)附近的極小區(qū)域內(nèi)才能發(fā)生，無需共聚焦針孔便可實(shí)現(xiàn)三維高分辨成像，如圖 2(b)所示。同時(shí)，激發(fā)光光子的能量減為單光子激發(fā)時(shí)的1/n，因此波長約為單光子激發(fā)波長的n倍，可采用近紅外超快激光作為激發(fā)光源。長波長的近紅外光比短波長的光對細(xì)胞毒性小，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。樣本更深穿透(雙光子＞500 μm；單光子100 μm)，雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來觀察厚標(biāo)本，更適合用來觀察活細(xì)胞甚至活組織的三維、四維實(shí)時(shí)觀測(如圖 3)[11-12]。但是，雙光子顯微鏡不能用于可吸收紅外樣品，如色素等，分辨率低于標(biāo)準(zhǔn)共聚焦(低一半)，短脈沖比長脈沖有更大細(xì)胞損害，在對焦面熒光漂白比標(biāo)準(zhǔn)單光子大[21]，并且激光系統(tǒng)貴而復(fù)雜,只可應(yīng)于熒光成像。

2 雙光子成像技術(shù)研究熱點(diǎn)

由于激光照射會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞漂白和傷害細(xì)胞，所以使用光學(xué)顯微鏡觀察活體細(xì)胞是獲得高信噪比圖像和觀測中對細(xì)胞致?lián)p的平衡。沒有哪個(gè)單獨(dú)的顯微系統(tǒng)能夠滿足一切要求，必須找到最佳折衷點(diǎn)。文獻(xiàn)[22]給出了在設(shè)計(jì)成像系統(tǒng)之前，首先需要考慮檢測靈敏度、捕獲速度和樣本的生存能力三個(gè)因素，以及在具體處理時(shí)的一些基本原則。另外，還強(qiáng)調(diào)在整個(gè)觀測裝置的設(shè)計(jì)中，保持細(xì)胞環(huán)境不變也是非常重要的，如在時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)中，一旦正在對樣本進(jìn)行成像，則焦平面必須保持穩(wěn)定。選擇合適的技術(shù)手段，對于整個(gè)觀測裝置的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)，具有很重要的指導(dǎo)意義。

2.1 減小細(xì)胞損害

對于活體成像和長時(shí)間成像，最重要的是要保證細(xì)胞的正常生長。熒光團(tuán)受光照后產(chǎn)生的氧化物質(zhì)與蛋白質(zhì)、核酸和脂肪等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使熒光信號(hào)降低（光致退色），并降低活體細(xì)胞壽命（光線損傷）。在光照過程中氧化劑的產(chǎn)生，主要決定于熒光團(tuán)的光化學(xué)性質(zhì)和光照劑量，因此減少光照劑量成為解決上述問題的途徑之一[21-22]。需要盡可能地減少激光照射時(shí)間和照明度。要移除不需要的波長的光，這不能僅僅依靠激勵(lì)濾鏡，而必須進(jìn)行光源優(yōu)化設(shè)計(jì)。減少氧氣的級(jí)別也可以減小光漂白和自由基的產(chǎn)生，這需要控制細(xì)胞生長環(huán)境的氧氣含量。減小酚紅含量可以減小背景熒光。成像系統(tǒng)必須充分利用光線，所以必須選擇大數(shù)值孔徑的目鏡，盡量減小光路的光學(xué)組件。CCD和光電倍增管等感光傳感器的靈敏度也非常重要，因?yàn)殪`敏度越高對于光強(qiáng)的要求越低，越有利于減小激發(fā)光強(qiáng)度。

當(dāng)然，最重要的還是減少光照量。有文獻(xiàn)[23]提出一種利用閉環(huán)控制技術(shù)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化光照劑量的細(xì)胞成像系統(tǒng) (CLEM)，在確保成像信噪比的同時(shí)降低了光致退色和光線損害。對于傳統(tǒng)熒光細(xì)胞成像技術(shù)，視野中各像素點(diǎn)的光照劑量完全相同，所用光照劑量應(yīng)確保使熒光團(tuán)低濃度區(qū)成像的信噪比達(dá)到設(shè)計(jì)要求。這意味著熒光團(tuán)高濃度區(qū)成像的信噪比將高于所需要指標(biāo)，而對于背景區(qū)由于不存在熒光團(tuán)，所以根本不需要激勵(lì)光照。文獻(xiàn)提出的成像系統(tǒng)對背景區(qū)、低熒光團(tuán)濃度區(qū)和高熒光團(tuán)濃度區(qū)施加不同的光照劑量，在保證信噪比的同時(shí)最大限度地減輕了光致退色和光線損傷。如圖4(a)所示，可通過降低熒光團(tuán)高濃度區(qū)和背景區(qū)光照劑量，減輕光致退色和光線損傷。將光照劑量空間分布和各像素點(diǎn)檢出信號(hào)進(jìn)行合成，獲得最終圖像。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，在傳統(tǒng)成像系統(tǒng)中增加了聲光調(diào)節(jié)器（AOM）和反饋回路(Feedback electronics)，如(圖4 (b)所示。聲光調(diào)節(jié)器用于實(shí)現(xiàn)像素保持時(shí)間內(nèi)激勵(lì)光束的開啟和關(guān)閉，反饋回路根據(jù)檢出信號(hào)控制聲光調(diào)節(jié)器開啟和關(guān)閉時(shí)間，并由檢出信號(hào)和激勵(lì)光強(qiáng)分布合成最終圖像。

圖 4 閉環(huán)的方法減小光損害Fig.4 Concept and Implementation of CLEM

當(dāng)然，對于某些具有非中心對稱結(jié)構(gòu)的細(xì)胞或組織，如膠原蛋白、細(xì)胞外間質(zhì)的筋膜和眼角膜等，可以利用雙光子結(jié)合二次諧波成像技術(shù)（SHG）實(shí)現(xiàn)成像（原理如圖 1）。二次諧波技術(shù)和雙光子顯微鏡在裝置上具有通用性，SHG信號(hào)收集不受前向發(fā)射性質(zhì)的限制，可以背向收集信號(hào), 因此很容易與雙光子顯微成像聯(lián)合使用，進(jìn)行成像比較，實(shí)現(xiàn)信號(hào)互補(bǔ)。SHG除了具有雙光子熒光成像的優(yōu)點(diǎn)外，還具有獨(dú)特的一系列成像優(yōu)勢，二次諧波成像過程中不需要熒光染色，沒有能量吸收，從根本上消除了對樣品的光致毒和光損傷[24-25]。

2.2 提高成像靈敏度

成像靈敏度決定著最終成像的質(zhì)量。更高的成像靈敏度決定著微弱熒光的檢測和成像，實(shí)現(xiàn)更小的單細(xì)胞細(xì)節(jié)成像，從而獲取更多的生物信息。當(dāng)然，雙光子顯微技術(shù)比以往的熒光技術(shù)具有更高的靈敏度，但是也需要在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高。

在雙光子顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用入射光發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)產(chǎn)生的隱失波來激發(fā)樣品中的熒光分子，實(shí)現(xiàn)寬場、非掃描全內(nèi)反射雙光子成像，可以提高成像的靈敏度。由于隱失波屬于近場波，其傳播距離僅為200 nm左右，深層區(qū)域的熒光分子不被激發(fā)，熒光檢測背景大為降低，因而利用這種方法得到的圖像信噪比和靈敏度均大為提高，在活細(xì)胞研究中可達(dá)到單個(gè)生物大分子水平。在既解決了雙光子熒光顯微鏡低信噪比問題的同時(shí)，又保留了可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像的特點(diǎn)，在單個(gè)活細(xì)胞分析及活細(xì)胞內(nèi)生物單分子研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢。近年逐漸成熟的雙光子全內(nèi)反射技術(shù)，更是將這些優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮到了極致[26-28]。

生物學(xué)家通過新的熒光染料的設(shè)計(jì)[29][30]，借助熒光分子的特性進(jìn)行成像，提高成像的靈敏度。熒光共振能量轉(zhuǎn)移[31-32]法，是指兩個(gè)攜帶不同熒光基團(tuán)的大分子之間，或同一分子的不同熒光團(tuán)之間，通過電偶極相互作用所發(fā)生的非輻射能量轉(zhuǎn)移，提供能量和接受能量的分子或者熒光團(tuán)分別稱為供體(donor，D)和受體(acceptor，A)。直觀的表現(xiàn)是當(dāng)供體熒光分子和受體熒光分子相互靠近到合適距離時(shí)，若激發(fā)供體分子，其發(fā)熒光的幾率比其單獨(dú)存在時(shí)要小得多，而受體分子發(fā)熒光的幾率卻大大提高，從而大大提高成像靈敏度。另外，熒光壽命成像，可通過測定單分子熒光的壽命來研究其所處細(xì)胞微環(huán)境或與其它分子的相互作用。熒光關(guān)聯(lián)譜技術(shù)，可通過檢測分子的擴(kuò)散系數(shù)、化學(xué)反應(yīng)速率等動(dòng)力學(xué)參量來研究生物單分子的擴(kuò)散、聚集和翻轉(zhuǎn)等過程。光漂白后熒光恢復(fù)技術(shù)，可通過檢測進(jìn)入特定光漂白區(qū)域的未漂白熒光分子來研究生物單分子的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移或透膜等運(yùn)動(dòng)過程。光漂白中的熒光損失，可通過檢測鄰近重復(fù)光漂白區(qū)的特定區(qū)域內(nèi)熒光的減少或消失來研究細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)生物單分子的運(yùn)動(dòng)等。這些新技術(shù)有其獨(dú)特的應(yīng)用背景，都可提高成像的靈敏度。

同時(shí)，CCD的靈敏度也關(guān)系到成像靈敏度。CCD制冷技術(shù)有利于減小暗電流，提高信噪比，提高CCD的靈敏度?，F(xiàn)在出現(xiàn)了可見光范圍量子效率達(dá)45%以上和增益可達(dá)106的ICCD器件（像增強(qiáng)型電荷耦合器件），大大提高系統(tǒng)的靈敏度。

2.3 提高數(shù)據(jù)獲取速度

數(shù)據(jù)獲取速度是另外一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，特別是在對于多種熒光團(tuán)同時(shí)成像或通過成像對于某種探針含量測量時(shí)。成像過程越短，光致漂白小，光毒性越小，則測量結(jié)果越準(zhǔn)確，成像效果越好[22]。 激光器與濾鏡切換或單光器輸出會(huì)減慢數(shù)據(jù)獲取速度。由于通過光纖傳輸，所以基于單色光的系統(tǒng)有利于加快激勵(lì)波長的切換，提高系統(tǒng)的數(shù)據(jù)獲取速度，但是會(huì)減小光照密度。濾光輪結(jié)構(gòu)可以提高熒光產(chǎn)量，但是會(huì)減慢切換速度，從而降低數(shù)據(jù)獲取速度。一般來說，對于小樣本區(qū)域成像，常規(guī)共聚焦掃描激光顯微鏡的獲取速度已經(jīng)足夠，但是對于某些化學(xué)物質(zhì)活性成像，例如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)，則需要借助光纖共振掃描探頭進(jìn)行掃描[33]。

對于CCD傳感器，成像是對于整個(gè)視場一次成像，而掃描過程則是一個(gè)像素接著一個(gè)像素，所以另外對于數(shù)據(jù)獲取速度的重要考慮是多焦點(diǎn)成像。此即是將激勵(lì)光分成幾份，同時(shí)激發(fā)樣本，而通過CCD同時(shí)獲取數(shù)據(jù)。尼普科夫圓盤共聚焦顯微鏡就是利用這個(gè)原理，可以實(shí)現(xiàn)每秒360幀成像速度[22]。CCD系統(tǒng)的讀出速度也是非常關(guān)鍵的，根據(jù)每次成像特點(diǎn)，更好的光電匹配設(shè)計(jì)是必須的。

3 結(jié)論

自從早期生物學(xué)家借助光學(xué)顯微技術(shù)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)，當(dāng)傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡不能滿足人們的研究需要時(shí),非線性光學(xué)顯微鏡以其獨(dú)特的成像優(yōu)勢走上歷史舞臺(tái)。近年隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，fs(飛秒)激光器的發(fā)展，先進(jìn)共聚焦激光掃描顯微鏡的發(fā)展，使借助雙光子顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞活體觀察成為可能。但是，沒有某種成像技術(shù)可以滿足所有的要求，所以需要科學(xué)家的共同努力。首先，快速發(fā)展的活細(xì)胞顯微成像需要提供新的熒光探針，以便于我們研究大量各式各樣的蛋白質(zhì)；需要提高顯微系統(tǒng)和成像軟件的性能，以便提高成像的質(zhì)量； 技術(shù)上橫向與其他成像技術(shù)結(jié)合發(fā)展,縱向朝更高性能方面提升,進(jìn)行更細(xì)致、更精確的成像和處理。各種先進(jìn)的商業(yè)顯微鏡，使很多非專業(yè)人員可以很容易使用雙光子顯微鏡進(jìn)行科學(xué)研究。但是，還需要在提高樣本生存能力、提高數(shù)據(jù)獲取速度及提高系統(tǒng)靈敏度三個(gè)方面進(jìn)一步研究。一些新技術(shù)[22]，例如自適應(yīng)計(jì)算光學(xué)廣泛用于天文學(xué)方面，可以用于厚樣本熒光成像的縮進(jìn)量校正；類似于原子顯微鏡的近場掃描顯微鏡可以和熒光技術(shù)相結(jié)合，用于樣本表面成像，大大提高光學(xué)分辨率。同時(shí)，一些制藥和生物技術(shù)公司需要大規(guī)模細(xì)胞內(nèi)部細(xì)節(jié)自動(dòng)分析和動(dòng)態(tài)控制，這也為雙光子顯微技術(shù)提供了機(jī)會(huì)，大大擴(kuò)展了雙光子熒光成像技術(shù)的應(yīng)用?？梢灶A(yù)見，雙光子顯微成像技術(shù)必將得到更大的發(fā)展，并且必將給生物技術(shù)和生命科學(xué)帶來一場強(qiáng)有力的革命。

[1] W. Denk, J. H. Strieker, W. W. Webb. Two-photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy[J]. Science, 1990, 248: 73-76.

[2] F. Helmchen, W. Denk. Deep tissue two-photon microscopy[J]. Nature Methods, 2005, 2: 932-940.

[3] R. N. Germai, M. J. Miller, M. L. Dustin, et al. Dynamic imaging of the immune system: Progress, Pitfalls and Promise [J]. Nature Reviews. Immunology. 2006, 6: 497-507.

[4] Vasilis Ntziachristos, Ching-Hsuan Tung, et al. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo [J]. Nature Medicine. 2002, 8(7):757-760.

[5] Yaron Shav-Tal, Robert H. Singer, Xavier Darzacq. Imaging gene expression in single Living cells [J]. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2004, 5: 856-862.

[6] D. M. McDonald, P. L. Choyke. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic [J]. Nature Medicine. 2003, 9(6): 713-725

[7] M. N. Teruel, W. Chen, A. Persechini, et al. Differential codes for free Ca2+Calmodulin Signals in Nucleus and Cytosol [J]. Curr Biol. 2000, 10: 86-94.

[8] A. Takahashi, O. P. Camach, J. D. Lechleiter, et al. Measurement of Intracellular Calcium [J]. Physiol Rev, 1999, 79: 1089-1125.

[9] 于力方, 廖杰, 張國慶. 熒光顯微數(shù)字成像系統(tǒng)對神經(jīng)元內(nèi)游離鈣的動(dòng)態(tài)測量[J]. 中國激光醫(yī)學(xué)雜志. 2005,14(3): 154-156.

[10] Richard Wingate, Marius Kwint. Imagining the brain cell: the neuron in visual culture [J]. Nature Reviews. Neuroscience. 2006, 7: 745-752.

[11] M. Oheim, E. Beaurepaire, E. Chaigneau, et al. Two-photon microscopy in brain tissue: parameters influencing the imagingdepth [J]. Journal of Neuroscience Methods, 2001, 111: 29-37.

[12] Z. F. Mainen, S. M. Maletic, S. H. Shi, et al. Two-photon imaging in living brain slices. methods, 1999, 18(2): 231-239.

[13] J. Eilers, A. Konnerth. Dendritic signal integration. curr opin Neurobiol, 1997, 7(3): 385.

[14] B. R. Masters, P. T. So, E. Gratton, et al. Multiphoton excitation microscopy of in vivo human skin. Ann NY Acad Sci. 1998, 838: 58.

[15] Qianru Yu, A. A. Heikal. Two-photon autofluorescence dynamics imaging reveals sensitivity of intracellular nadh concentration and conformation to cell physiology at the single-celllevel [J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2009, 95:46-57.

[16] M. Oheim, D. J. Michael, M. Geisbauer, et al. Principles of twophoton excitation fluorescence microscopy and other nonlinear imaging approaches [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2006, 58:788-808.

[17] A. Diaspro, M. Robello. Two-photon excitation of fluorescence for three-dimensional optical imaging of biological structures [J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2000, 55(1): 1-8.

[18] G. E. Stutzmann, I. Parker. Dynamic multiphoton imaging: a live view from cells to systems [J]. Physiology, 2005, 20(2):15-21.

[19] V. Nikolenko, B. Nemet, and R. Yuste. A two-photon and secondharmonic microscope [J]. Methods, 2003, 30: 3-15.

[20] S. M. Potter. Vital Imaging: Two photons are better than one. current biol, 1996, 6: 1596-1598.

[21] Alexander Hopt, Erwin Neher. Highly nonlinear photodamage in two-photon fluorescence microscopy[J]. Biophysical Journal, 2001, 80(4): 2029-2036

[22] D. J. Stephens, V. J. Allan. Light microscopy techniques for live cell imaging [J]. Science, 2003, 300(5616): 82-87.

[23] R. A. Hoebe, C. H. Van Oven, T. W. J. Gadella Jr, et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology, 2007, 25(2): 249-253

[24] P. J. Campagnola, H. A. Clark, W. A. Mohler. Second-harmonic imaging microscopy of living Cells [J]. Journal of Biomedical Optics, 2001, 6(3): 277-286.

[25] P. J. Campagnola, L. M Loew. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms [J]. Nature Biotechnology, 2003, 21(11): 1356-1360.

[26] 王琛, 王桂英, 徐至展. 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)[J]. 物理學(xué)進(jìn)展, 2002. 22(4): 406-415.

[27] F. Schapper, J. T. Gonslves, M. Oheim. Fluorescence imaging with two-photon evanescent wave excitation [J]. European Biophysics Journal, 2003, 32: 635-643.

[28] I. Gryczynski, Z. Gryczynski, J. R. Lakowicz. Two-photon excitation by the evanescent wave from total internal reflection [J]. Analytical Biochemistry, 1997, 247: 69-76.

[29] Haibo Xiao, Hui Li, Minjuan Chen, et al. A water-soluble D-π-A chromophore based on dipicolinic acid: synthesis, ph-dependent spectral properties and two-photon fluorescence cell imaging[J]. Dyes and Pigments, 2009, 83: 334-338.

[30] Kim O-K, Lee K-S, Woo HY, et al. New class of two-photonabsorbing chromophores based on dithienothiophene[J]. Chem Mater, 2000, 12: 284-286.

[31] 林丹櫻. 單個(gè)活細(xì)胞多功能高靈敏實(shí)時(shí)熒光顯微成像研究[D].清華大學(xué)博士學(xué)位論文, 2008.

[32] K. Kikuchi. Small molecule-based FRET sensors which enable ratiometric imaging of living cells [J]. Bioimages, 2004, 12(2-4): 55-60

[33] R. Salomé, Y. Kremer, S. Dieudonné, et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy[J]. Journal of Neuroscience Methods, 2006, 154: 161-174.

Advances in Two-photon Imaging Technology

【 Writers 】

Xia Weiqiang1, ZhouYuan2, Shi1 Ming2
1 School of Instrumentation Science and Optoelectronics Engineering, Beijing University of Aeronautics and Astronautics, Beijing, 100191, China
2 Hebei Chengde Experiment Middle School, Chengde, Hebei, 167101, China

【 Abstract 】As a new kind of advanced nonlinear imaging approach, two-photon fluorescence microscopy technology is wildly used in the field of live cell and tissue imaging，especially focusing on long-term dynamic three-dimensional cell imaging. This paper firstly presents the principle and characteristic of two-photon fluorescence microscopy. Then, the paper focuses on the three key aspects of the viability of the specimen, sensitivity of detection, as well as the speed of acquisition. In the end, the future prospect of development and application of two-phonon imaging technology are predicted

two-photon imaging, total Internal reflection imaging, live cell imaging, 3-D cell imaging, photo bleaching

Q693

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2011.03.011

1671-7104(2011)03-0204-05

2011-1-17

周源，E-mail:zhouyuanlulu@haotmail.com