王曉清，張敬澤，褚福強(qiáng)，張艷麗，郭得平

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州，310058）

茭白黑粉菌脈沖電泳分析方法

王曉清，張敬澤，褚福強(qiáng)，張艷麗，郭得平

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州，310058）

采用脈沖電泳法對(duì)茭白黑粉菌染色體進(jìn)行核型分析。分析結(jié)果表明，茭白黑粉菌脈沖電泳樣品處理方法包括原生質(zhì)體的制備、電泳參數(shù)的設(shè)置等，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響，在制備電泳樣品時(shí)，包埋的原生質(zhì)體或孢子的濃度不能太低，蛋白酶K的濃度不能過(guò)高，低熔點(diǎn)瓊脂糖的濃度不能太低，此外還應(yīng)確保電泳槽水平，并且電泳結(jié)束后及時(shí)取出凝膠。

茭白黑粉菌；原生質(zhì)體；脈沖電泳；核型分析

在茭白（Zizania latifoliaTurcz.）生長(zhǎng)期間，茭白黑粉菌（Ustilago esculentaP．Henn.）與茭白植株共生，并在茭白植株體內(nèi)分泌代謝產(chǎn)物刺激茭白莖基部膨大形成肉質(zhì)莖[1]。茭白黑粉菌誘導(dǎo)茭白莖膨大的機(jī)制目前還不清楚，主要與茭白黑粉菌和植株互作的分子機(jī)制研究缺少有關(guān)，因此，深入研究其分子生物學(xué)特性亟待進(jìn)行。

核型是指動(dòng)物、植物、真菌等真核生物的某一個(gè)體或某一分類(lèi)群的細(xì)胞內(nèi)染色體組中染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)[2]。明確基因組染色體數(shù)目和大小是基因組分析的基礎(chǔ)工作，對(duì)搞清基因組DNA的全部核苷酸順序結(jié)構(gòu)，識(shí)別所有基因的編碼，測(cè)定基因的位置及它們的功能有重要意義，是分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)性工作[3]。

由于真菌染色體較小以及可能獲得的遺傳標(biāo)記較少，因此難以用傳統(tǒng)的染色體技術(shù)和光學(xué)顯微鏡觀察或通過(guò)基因間建立遺傳學(xué)連鎖關(guān)系的方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。脈沖電泳技術(shù)可分離大分子量的DNA的極限為10 Mb，為真菌染色體的研究提供了技術(shù)平臺(tái)[4]。脈沖電泳廣泛用于真菌的核型分析，通過(guò)它可以直接得到真菌染色體的數(shù)目，每條染色體分子量以及染色體總量。本方法參考了多位前人脈沖電泳的方法，采用改進(jìn)的脈沖電泳法對(duì)茭白黑粉菌染色體組進(jìn)行核型分析。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

取已分離、純化的茭白黑粉菌單孢菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，在28℃，180 r/min條件下?lián)u瓶。培養(yǎng) 48 h后，將培養(yǎng)基倒入 50 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，收集孢子。

液體培養(yǎng)基：蔗糖10 g，葡萄糖10 g，L-Asp 2 g，馬鈴薯200 g，水1 000 mL。按照各物質(zhì)使用濃度要求加入青霉素、鏈霉素、維生素B1。

1.2 主要試劑及儀器

STC緩沖液：0.05 mol/L Tris-His（pH=8.0），0.05 mol/L CaCl2，0.8 mol/L山梨醇；酶液：用0.7 mol/L NaCl配制10 mg/mL溶解酶 （Sigma）+10 mg/mL崩潰酶（Sigma）+10 mg/mL蝸牛酶（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）的混合酶液后，8 800 r/min離心，上清液用直徑0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

蛋白酶K緩沖液：100 mmol/L EDTA（pH= 8.0）、1%月桂酰肌氨酸、0.2%脫氧膽酸鈉、1 mg/mL蛋白酶K[5]。

SCE緩沖液：1 mol/L山梨醇，20 mmol/L檸檬酸鈉（pH=5.8），10 mmol/L EDTA。

低熔點(diǎn)瓊脂糖、蛋白酶K、Tris、EDTA、溴化乙錠、高強(qiáng)度瓊脂糖、月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他試劑均為分析純。

表1 電泳參數(shù)設(shè)置

主要儀器有水平搖床、低溫離心機(jī)、具有Axiocam CCD攝像頭和Axiovision數(shù)字成像軟件（Axio Vision Software Release 3.1.， Carl Zeiss Vision Imaging Systems）的Zeiss Axiophot 2顯微鏡、電泳系統(tǒng)（Bio-Rad CHEF Mapper）、數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（Fine-do X3）。

1.3 茭白黑粉菌原生質(zhì)體的獲得

①將離心收集到的孢子用無(wú)菌水振蕩、離心洗滌2次。再用0.7mol/LNaCl溶液振蕩、離心洗滌1次。

②盡量倒干水分，加入酶液（菌體∶酶液=1 g∶10 mL），搖動(dòng)以混合均勻。30℃，100 r/min酶解3 h[6]。30 min后觀察有無(wú)原生質(zhì)體釋放，以后每隔30 min觀察1次。

③酶解后的原生質(zhì)體用4層擦鏡紙過(guò)濾，過(guò)濾前先用STC緩沖液潤(rùn)濕擦鏡紙，過(guò)濾完后用STC緩沖液沖洗擦鏡紙。

④將收集到的濾液4 000 r/min，4℃離心10 min，移液槍吸取上清，檢查是否有原生質(zhì)體。若上清有原生質(zhì)體，再次離心。至上清無(wú)原生質(zhì)體時(shí)，棄上清，收集沉淀的原生質(zhì)體。分別用0.7 mol/L NaCl溶液和STC緩沖液離心洗滌收集到的原生質(zhì)體1次。

⑤向離心收集的原生質(zhì)體中加入1 mL STC緩沖液，輕輕混合均勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用STC緩沖液調(diào)至原生質(zhì)體濃度大約為108個(gè)/mL，然后立即42℃預(yù)熱備用或加甘油于-80℃冰箱中保存。

1.4 電泳樣品準(zhǔn)備

①將450 μL 42℃預(yù)熱的原生質(zhì)體懸浮液與750 μL預(yù)冷至42℃的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液 （用STC緩沖液配制）混合均勻，用移液槍吸取混合物于模子中，避免產(chǎn)生氣泡。每個(gè)模子80 μL，室溫凝固15 min左右[7]。

②一旦凝固，在50 mL離心管上做好標(biāo)記，每管加入20 mL蛋白酶K緩沖液。打開(kāi)模具，將膠塊移入相應(yīng)的管子中，50℃水浴，24 h[5]。

③棄去溶液，用 10 mmol/L Tris（pH=8.0）和50 mmol/L EDTA的混合液洗膠塊4次，共1 h，輕微震蕩。

④洗完后，將膠塊放在0.5 mol/L EDTA（pH= 8.0）中，30 min后將膠塊保存在4℃，新的0.5 mol/L EDTA（pH=8.0）中。

1.5 進(jìn)行脈沖電泳

①調(diào)整梳子的高度，使梳子齒與膠槽的底面有一定間距，調(diào)整膠槽使其水平。

②將EDTA從管中吸出，加入200 μL電泳緩沖液，室溫緩沖10～15 min。

③稱(chēng)取高強(qiáng)度瓊脂糖于100 mL電泳緩沖液中，加熱溶解后冷卻至60℃。

④把膠塊加在梳子齒上，干燥約3 min后，從膠槽的下部中央緩慢倒入配制好的瓊脂糖溶液，室溫凝固30 min。

⑤小心拔去梳子，加緩沖液于電泳槽中，用熔化的膠封閉加樣孔，設(shè)置參數(shù)開(kāi)始電泳（表1）。

⑥據(jù)每次分離染色體片段大小選定Marker。

1.6 染色拍照

①電泳結(jié)束后，用0.5 μg/mL的溴化乙錠電泳緩沖液或水進(jìn)行凝膠的染色，30～45 min。

②室溫下用水將已經(jīng)染色的凝膠浸泡30 min脫色，可以降低由未結(jié)合的溴化乙錠所引起的背景熒光。

③數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)觀察染色體大小、數(shù)目，并拍照。

2 操作中應(yīng)注意的事項(xiàng)

①制備電泳樣品時(shí)，包埋的原生質(zhì)體或孢子的濃度不能太低。若其濃度太低，則電泳的條帶較暗。

②蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高，都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核的消失，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。

③低熔點(diǎn)瓊脂糖的濃度不能太低。若其濃度較低，則會(huì)形成較大的孔道，電泳后可能看不到任何條帶；若其濃度太高，則瓊脂糖很容易凝固，不利于操作。

④要確保電泳槽是水平的。電泳結(jié)束后，及時(shí)取出凝膠，防止因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成條帶彌散。

3 小結(jié)與討論

不同的電泳參數(shù)跑出來(lái)的凝膠條帶個(gè)數(shù)是不同的，若條帶中有異常的明亮條帶出現(xiàn)，證明此處很可能是分子量相同或相近的兩條染色體重合在一起。需要再重新設(shè)置電泳參數(shù)，以分離重疊的染色體條帶。明亮的帶可能會(huì)隨著電泳條件的改善而出現(xiàn)更清晰的結(jié)果[9]。電泳過(guò)程是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，很多因素制約著試驗(yàn)結(jié)果的好壞。影響脈沖電泳分離效果的因素主要包括：電流強(qiáng)度、電泳溫度、瓊脂糖濃度、脈沖時(shí)間以及電場(chǎng)角度等[10～11]。在篩選電泳的影響因素時(shí)首先確定一個(gè)電泳條件，然后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，依次更改各個(gè)因素，以達(dá)到最佳效果[12]。

制備原生質(zhì)體法是完整染色體DNA獲得中最經(jīng)典的方法，適用范圍較廣[12]。但重要的是試驗(yàn)中要獲得較高濃度的原生質(zhì)體，因此要對(duì)原生質(zhì)體的制備條件進(jìn)行摸索。另外還可以采用液氮研磨法，此方法無(wú)須用溶壁酶破壁，這就使得制備完整染色體DNA的過(guò)程大大簡(jiǎn)化，因此有很好的發(fā)展前景。但不足的地方在于研磨菌絲體過(guò)程中極可能導(dǎo)致染色體DNA斷裂。該方法要求試驗(yàn)操作者有較好的試驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)。

本技術(shù)用于分離茭白黑粉菌的染色體，可以探索茭白黑粉菌的染色體大小和數(shù)目。為其之后的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)的深入研究提供條件，將極大地推動(dòng)茭白黑粉菌分子生物學(xué)方面的研究。但該試驗(yàn)方法是對(duì)茭白黑粉菌核型分析方面的首次探索，仍需在今后的研究中不斷改進(jìn)。

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Protocol for pulsed field gel electrophoresis ofUstilago esculenta

WANG Xiaoqing,ZHANG Jingze,CHU Fuqiang,ZHANG Yanli,GUO Deping
(College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058)

Karyotype ofUstilago esculentawas analyzed by pulsed field gel electrophoresis.The experiment results were affected by the sample treatment methods of pulsed field gel electrophoresis ofU.esculenta,including protoplast preparation and entrapment.While preparing the test samples,the concentration of embedded protoplast or spore and low melting point agarose can't be too low,and the concentration of proteinase K can't be too high.In addition,the electrophoresis tank should be placed horizontally,and the gel should be taken out timely after the electrophoresis.

Ustilago esculenta;Protoplast;Entrapment;Pulsed field gel electrophoresis;Karyotype

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.029

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“水生蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研究與示范”（200903017-03）

王曉清（1988-），女，碩士，主要從事蔬菜學(xué)研究，電話：0571-88982796，E-mail：xccghh_620@163.com

郭得平，通信作者，E-mail：dpguo@zju.edu.cn

2011-07-11