施世明，洪霓

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院，湖北武漢，430070）

湖北及山東地區(qū)栽培芋病毒病的田間調(diào)查及其病原的分子檢測

施世明，洪霓

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院，湖北武漢，430070）

對湖北及山東地區(qū)種植的芋調(diào)查發(fā)現(xiàn)，田間芋病毒病發(fā)生普遍，癥狀表現(xiàn)主要有花葉、羽狀斑駁、畸形皺縮、褪綠斑點等。2010年9月30日對武漢蔬菜科學研究所國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃種植的芋進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，以上4種癥狀的田間顯癥率分別為26.92%，16.67%，28.21%和3.85%，田間調(diào)查時未發(fā)現(xiàn)蚜蟲等媒介昆蟲。對不同來源的芋葉片樣品進行芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）的RT-PCR檢測，各癥狀田間檢出率為21.1%～42.9%。

芋；病毒病；芋花葉病毒；田間調(diào)查；分子檢測

芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]又名芋頭、芋艿、毛芋等，為天南星科（Araceae）芋屬（Colocasia）多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于中國、印度和馬來半島等熱帶沼澤地區(qū)，現(xiàn)已在世界各國廣泛種植。芋是一種具有地域特色的水生蔬菜，主要以其膨大的肉質(zhì)球莖供食用，有些種類的葉柄和花梗也可作蔬菜食用。芋屬典型的無性繁殖作物，多采用球莖繁殖，在其長期的無性繁殖過程中，植株中病毒數(shù)量不斷積累、種類不斷增加，導致病毒病為害逐年加重，且品種退化嚴重，造成芋產(chǎn)量和品質(zhì)下降。隨著我國芋種植面積逐步增大，芋病毒病在我國栽培芋上發(fā)生越來越普遍[1]，因此防治芋病毒病已引起人們的高度重視。前期研究表明，侵染芋植株的病毒達8種之多[2～6]，國內(nèi)報道的有芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）2種，其中DsMV分布最廣，為害最大[6]。本研究主要對湖北及山東種植芋的病毒病進行了相關田間調(diào)查，并對其主要病原病毒DsMV進行了RT-PCR檢測，以期為生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 芋病毒病田間調(diào)查

2010年4～11月對湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學周邊、蔡甸馬家渡、蔡甸索河鎮(zhèn)、武漢蔬菜科學研究所、仙桃、山東臨沂等地種植的水芋及旱芋進行了田間調(diào)查并采集病樣，選取武漢蔬菜科學研究所國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃所種植的芋進行病毒病癥狀調(diào)查，記錄不同癥狀顯癥株數(shù)并計算發(fā)生頻率。

1.2 芋花葉病毒的RT-PCR檢測

①樣品來源 從湖北及山東收集芋葉片樣品共81份，其中多數(shù)樣品植株的葉片表現(xiàn)花葉或羽狀斑駁等癥狀。

②所用引物 用于該病毒檢測的引物為DsMV-1/DsMV-2：5'-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3'/5'-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3'，根據(jù)陳集雙[7]的報道合成序列，其擴增片段為357 bp，擴增區(qū)域為cp基因中間部分核心序列；所用引物由上海生工生物技術有限公司合成。

③總RNA提取 取待檢材料嫩葉0.1 g，加液氮研磨成粉狀，快速轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入1 mL RNA提取緩沖液 （含50%異硫氰酸胍、5 mol/L苯酚等），劇烈混勻，室溫靜置5 min后離心，上清液經(jīng)氯仿抽提2次后，加入2/3體積的異丙醇沉淀核酸，沉淀物經(jīng)75%乙醇洗滌2次，風干后，溶于30 μL DEPC處理水中，-20℃保存。

④RT-PCR 以提取的總RNA為模板，合成cDNA第1鏈，反應體系為20 μL，含5×反轉(zhuǎn)錄沖液4 μL、dNTPs（5 μmol/μL）1 μL、Rnasin（40 U/μL）0.5 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL、隨機引物（100 pmol/μL）1 μL、RNA模板3 μL和DEPC處理水10 μL。PCR反應總體系為25 μL，含10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（5 μmol/μL）0.5 μL、Taq DNA聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL、正反向引物各0.5 μL（10μmol/μL）、cDNA2μL和滅菌的去離子水18.8 μL。擴增條件為：94℃變性3 min；然后94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后在溴化乙錠中染色10 min，最后凝膠成像、觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋病毒病田間調(diào)查結(jié)果

調(diào)查發(fā)現(xiàn)田間芋病毒病發(fā)生普遍，發(fā)病重的田塊田間病毒病顯癥率達50%以上。芋從苗期（4月）到收獲期 （11月）的整個生長期內(nèi)均表現(xiàn)出病毒病癥狀，其中在生長盛期（6～8月）癥狀表現(xiàn)最為明顯。癥狀表現(xiàn)主要有花葉、羽狀斑駁、畸形皺縮、矮化、黃化、褪綠斑點等（圖1），其中水芋表現(xiàn)以花葉為主，旱芋病癥則表現(xiàn)多樣。2010年9月30日調(diào)查武漢市蔬菜科學研究所國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃種植的旱芋病毒病癥狀統(tǒng)計情況見表1。田間調(diào)查時未發(fā)現(xiàn)蚜蟲等為害芋的媒介昆蟲。

圖1 芋病毒病田間癥狀

表1 武漢蔬菜科學研究所國家水生蔬菜資源圃的芋病毒病癥狀田間調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果

2.2 DsMV的RT-PCR檢測結(jié)果

對來自湖北的79份芋葉片樣品進行了DsMV的RT-PCR檢測，部分樣品中檢測到357 bp的目標片段（圖2），對目標片段進行回收、克隆、測序，序列比對確定其為DsMV。檢測結(jié)果顯示，湖北不同地區(qū)樣品的DsMV檢出率為21.1%～42.9%，其中來自湖北蔡甸2個種植園的17份樣品的DsMV檢出率相對較高，為30.0%～42.9%；來自山東臨沂的3份隨機收集樣品中未檢測到該病毒，所有樣品總檢出率為24.7%（表2）。

3 小結(jié)與討論

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，芋病毒病從北到南發(fā)生逐步加重，水芋比旱芋發(fā)病重，可能與氣候、品種的抗性、栽培方式、生長環(huán)境等有關。北方以旱芋種植為主，因氣候寒冷干燥，不利于病毒的增殖，故病毒病為害發(fā)生較輕；因水芋產(chǎn)量較旱芋高，南方以水芋種植為主，南方氣候溫暖濕潤，利于病毒的增殖和傳播，加上水芋栽培中傳統(tǒng)的大水大肥的管理模式導致水芋病毒病發(fā)生嚴重。

圖2 部分芋葉片DsMV RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果（M：Marker II；1～8：待檢樣品；9：空白對照）

表2 不同來源芋的DsMV RT-PCR檢測結(jié)果

本研究中，與芋植株病毒病顯癥率相比，DsMV的檢出率明顯偏低，且低于前人的報道[6]，而且DsMV的檢出結(jié)果和樣品顯癥情況無明顯相關性，有些顯癥明顯的樣品未檢出DsMV，而有些檢出DsMV的樣品無明顯病毒病癥狀，這與前人研究結(jié)果一致[8]。造成此結(jié)果的原因可能有以下幾種：芋病毒病原存在著混合侵染現(xiàn)象，造成芋病毒病癥狀的病原可能有多種，而本研究只檢測了分布最廣、為害最大的DsMV，其他表現(xiàn)病毒病癥狀但未檢出DsMV的樣品可能是其他病原侵染所致。而且據(jù)前人報道[9]，DsMV也存在著較高的分子多樣性，可能存在著多種株系，而本研究所用的RT-PCR技術較高的特異性可能也導致了DsMV較低的檢出率。另外，DsMV侵染芋植株的顯癥機理尚不清楚，有待進一步研究。

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Field Investigation of Viral Disease and Molecular Detection of Pathogenic Virus on Cultivated Taro[Colocasia esculenta(L.)Schott]in Hubei and Shangdong

SHI Shiming,HONG Ni
(College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)

Field investigation of cultivated taro [Colocasia esculenta(L.)Schott]in Hubei province were carried out.The results showed that taro viral diseases were happened widespread,with the main symptoms of mottle-leaf,pinnate mottle, deformity shrinks and chlorotic spots.The rates of 4 symptoms occurring were 26.92%,16.67%,28.21%and 3.85%when the investigation conducted in the National Aquatic Vegetables Resources Nursery of Wuhan Vegetables Research Institute on the September 30th,2010.No insect vectors such as aphid were found in the investigation.RT-PCR was implemented to detect DsMV of taro from Hubei.The results showed that the rates of 4 symptoms occurring ranged from 21.1% -42.9%.

Colocasia esculenta;Viral diseases;Field investigation;Dasheen mosaic virus;Molecular detection

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.028

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903017-08）施世明（1986-），男，碩士，研究方向為植物病毒學

洪霓，教授，通信作者，研究方向為植物病毒學，電話：027-87283278，E-mail：whni@mail.hzau.edu.cn

2011-07-10