潘麗，朱志賢，呂茹婧，鄭露，黃俊斌

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070）

荸薺稈枯病菌生物學(xué)特性研究

潘麗，朱志賢，呂茹婧，鄭露，黃俊斌

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070）

為研究湖北地區(qū)荸薺稈枯病的發(fā)生規(guī)律，研究了其對不同理化環(huán)境和營養(yǎng)條件的需求。試驗(yàn)結(jié)果表明，荸薺稈枯病菌（Cylindrosporium eleocharidis）菌絲生長和分生孢子萌發(fā)溫度為5～35℃，最適溫度為25～30℃；病菌菌絲最適宜在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）中生長，最適宜在綠豆汁培養(yǎng)基（MBA）上產(chǎn)孢。pH值為4～10時，病菌菌絲均能生長，pH值為6～7時最適宜其生長；病菌能利用多種碳源和氮源，碳源以蔗糖和淀粉利用效果最好，氮源以酵母膏和蛋白胨利用效果最好；病菌菌絲的最低致死溫度為50℃水浴10 min，分生孢子最低致死溫度為55℃水浴10 min。

荸薺；稈枯??；荸薺柱盤孢；生物學(xué)特性

2008-2010年，荸薺稈枯病在湖北團(tuán)風(fēng)縣方高坪鎮(zhèn)荸薺種植基地發(fā)生嚴(yán)重，使得荸薺減產(chǎn)率達(dá)20%以上，重病田甚至絕產(chǎn)絕收，嚴(yán)重影響了荸薺的產(chǎn)量和品質(zhì)，給薺農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為弄清湖北地區(qū)荸 薺稈枯病菌 （Cylindrosporium eleocharidis）對不同理化環(huán)境和營養(yǎng)條件的需求，筆者對其生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為研究該病害的發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同培養(yǎng)基上荸薺稈枯病培養(yǎng)性狀的觀察及產(chǎn)孢量的測定

將荸薺稈枯病菌供試菌株TF2009-1（下同）分別接種到有PDA、PSA、OMA、OTA、CA、MBA、VA、CWA培養(yǎng)基的平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，10 d后觀察菌落的形態(tài)和顏色，并拍照。15 d后在菌落表面加入5 mL無菌水，用玻璃涂棒刮取表層菌絲，經(jīng)2層擦鏡紙過濾得到分生孢子懸浮液，將其分裝至2 mL離心管中，5 000 r/min離心1 min，離心后用接種槍將離心液吸至1個1.5 mL離心管中，定容至1 mL，然后用血球計數(shù)板測量分生孢子懸浮液濃度。每處理3個重復(fù)。

1.2 不同培養(yǎng)液對菌絲生長量的影響

將上述8種培養(yǎng)液（培養(yǎng)基配方中不加瓊脂）設(shè)為8個處理，每處理4個重復(fù)。量取100 mL培養(yǎng)液加至250 mL三角瓶中，每瓶接入1塊直徑為6 mm的在PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌落邊緣的菌絲塊，封口后置于25℃、180 r/min恒溫?fù)u床中光照培養(yǎng)，10 d后稱量菌絲干質(zhì)量。

1.3 不同溫度對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用孔徑為6 mm的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，移至新鮮的PDA平板中央。設(shè)置5，10，15，20，25，30，35，40℃共8個不同的溫度處理，將接好菌的培養(yǎng)皿封口后分別置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，每處理5個重復(fù)，10 d后用十字交叉法測量菌落直徑，比較不同溫度對病菌菌絲生長的影響。

將5 mL無菌水滴在PDA平板上生長15 d的菌落表面，用無菌玻璃涂棒刮取表面菌絲，經(jīng)2層擦鏡紙過濾得到分生孢子懸浮液，然后用2 mL離心管分裝，離心后去上清，用血球計數(shù)板測量懸浮液濃度，再加入無菌水將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至105個/mL，然后用無菌玻璃涂棒將100 μL分生孢子懸浮液均勻涂布在2%的水瓊脂平板上，分別置于上述8個不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，每處理5個重復(fù)，24 h后統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)率。

1.4 不同光照對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用孔徑為6 mm的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，移至新鮮的PDA平板中央，然后將平板置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照3個處理（光源為普通日光燈18 W、22 cm，下同），每個處理5個重復(fù)，10 d后用十字交叉法測量菌落直徑，比較不同光照條件對菌絲生長的影響。

分生孢子懸浮液的制備同1.3。用無菌玻璃涂棒將100 μL分生孢子懸浮液均勻涂布在2%的水瓊脂平板上，設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照3個處理，光照強(qiáng)度及培養(yǎng)溫度同上，24 h后統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)率（%）。

1.5 不同pH值對菌絲生長的影響

用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，pH值分別設(shè)置3，4，5，6，7，8，9，10，11。在不同pH值的平板上接種直徑為6 mm的新鮮菌絲塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，每處理4個重復(fù)，10 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.6 不同碳源和氮源對菌絲生長量的影響

以 Czapek培養(yǎng)液（2.00 g KNO3，1.00 g KH2PO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4，30.0 g蔗糖，1 000 mL蒸餾水）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液[1]。用含碳量相同的淀粉、D-甘露醇、D-半乳糖、葡萄糖、L-山梨醇、麥芽糖、檸檬酸、果糖、乳糖代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳源作對照，各處理4個重復(fù)。向250 mL的三角瓶中加入100 mL Czapek培養(yǎng)液，每瓶接入1個直徑為6 mm的新鮮菌絲塊，置于25℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中光照培養(yǎng)，10 d后稱量菌絲干質(zhì)量。

以Czapek培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液[1]，用含氮量相同的酵母膏、蛋白胨、甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、氯化銨、尿素和硝酸鈉代替其中的2.00 g硝酸鉀，以不加氮源作對照，每處理4個重復(fù)。病原菌培養(yǎng)及菌絲干質(zhì)量稱量方法同上。

1.7 菌絲體及分生孢子致死溫度測定

①菌絲致死溫度測定 用直徑為6 mm的無菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌絲塊，將菌絲塊置于加有1 mL無菌水的2 mL無菌離心管中，分別在35，40，45，50，55，60℃水浴鍋中處理10 min后取出冷卻，每處理5個重復(fù)，將菌絲塊取出，置于PDA平板上于25℃光照培養(yǎng)，10 d后觀察其生長情況。

②分生孢子致死溫度測定 分生孢子懸浮液的制備方法同1.3。將其濃度調(diào)至105個/mL，移取1 mL分生孢子懸浮液于1.5 mL的eppendorf管中，分別置于35，40，45，50，55，60℃的水浴鍋中處理10 min后取出冷卻。每處理5個重復(fù)，將各重復(fù)中的100 μL孢子懸浮液用無菌玻璃涂棒均勻涂布在2%的水瓊脂平板上，于25℃光照培養(yǎng)，24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用DPS 3.01軟件分析光照條件、溫度、pH值、不同碳源和氮源對菌絲生長、分生孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢量的影響，并用Tukey法比較不同處理間的差異顯著性（P=0.05）。用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對TF2009-1產(chǎn)孢量的影響

TF2009-1在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和培養(yǎng)性狀有差異，在OMB和CA上菌絲生長較稀疏。由圖1可知，TF2009-1在各培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量有顯著性差異，在MBA上產(chǎn)孢量最高，為17.3×105個/mL，其次為CWA、OTA和CA，產(chǎn)孢量分別為7.7×105，4.3×105，4.0×105個/mL，在 OMA、VA、PSA和PDA上的產(chǎn)孢量最低，分別為2.4×105，2.2×105，2.1×105，1.6×105個/mL。

圖1 不同培養(yǎng)基對TF2009-1產(chǎn)孢量的影響

2.2 不同培養(yǎng)液對菌絲生長量的影響

TF2009-1在不同培養(yǎng)液中的菌絲生物量存在顯著性差異。在PDB中菌絲生物量最高，為10.987 mg/mL，其后依次為 PSB、CWA、OTB、MBB、VB和CB，分別為9.517，7.093，6.150，4.360，3.770，3.572，3.190 mg/mL，在OMB中菌絲生物量最低，為3.190 mg/mL（圖2）。

圖2 不同培養(yǎng)液對TF2009-1菌絲生長的影響

2.3 不同溫度對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

菌絲在5～35℃的溫度范圍內(nèi)均能生長，最適宜生長溫度為25～30℃，5，10，35℃時，菌絲生長受到明顯抑制，40℃時菌絲不能生長（圖3）。

圖3 不同溫度對TF2009-1菌絲生長的影響

分生孢子在5～35℃溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)，15～ 35℃較適宜萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)80.0%以上；25℃最適宜萌發(fā)，萌發(fā)率為93.3%；5℃時抑制孢子萌發(fā)，萌發(fā)率僅為24.0%；40℃時孢子不能萌發(fā)（圖4）。

圖4 不同溫度對TF2009-1分生孢子萌發(fā)的影響

2.4 不同光照對菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

TF2009-1在PDA平板上連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)10 d后菌落平均直徑分別為7.04，7.28，7.20 cm，三者間無顯著性差異（圖5）。

圖5 不同光照對TF2009-1菌絲生長的影響

分生孢子在連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照條件下培養(yǎng)24 h后，分生孢子萌發(fā)率分別為97.7%，97.8%，96.7%，三者間無顯著性差異（圖6）。

圖6 不同光照對TF2009-1分生孢子萌發(fā)的影響

2.5 不同pH值對菌絲生長的影響

TF2009-1在不同pH值的培養(yǎng)基中生長，菌落平均直徑存在顯著性差異。培養(yǎng)基的pH值為3.0～ 10.0時，菌絲均能生長；pH值為4.0～10.0時，菌落平均直徑大于6.0 cm，較適宜菌絲生長；培養(yǎng)基pH值7.0時，病原菌生長最快，菌落平均直徑為8.03 cm；pH值3.0時，菌落生長最慢，菌落平均直徑為5.36 cm；培養(yǎng)基pH值為4.0，5.0，6.0，8.0，9.0和10.0時，菌落平均直徑分別為6.65，6.83，7.55，7.38，6.54，6.09 cm； pH值為11.0時，菌絲不能生長（圖7）。

圖7 不同pH值對TF2009-1菌絲生長的影響

2.6 不同碳源對菌絲生長的影響

TF2009-1在供試的10種不同碳源培養(yǎng)液和不加碳源（CK）的培養(yǎng)液中均能生長，菌絲生物量存在顯著性差異，其中病菌對蔗糖和淀粉的利用效果最好。180 r/min搖菌，光照培養(yǎng)7 d后，菌絲生物量分別為2.760，2.613 mg/mL；對D-甘露醇和D-半乳糖的利用效果次之，其菌絲生物量分別為1.133，1.130 mg/mL；對葡萄糖、L-山梨醇、麥芽糖、檸檬酸和果糖的利用效果較差，其菌絲生物量小于0.944 mg/mL；對乳糖的利用效果最差，其菌絲生物量為0.520 mg/mL，與CK中菌絲生物量0.527 mg/mL相比無顯著性差異（圖8）。

圖8 不同碳源對TF2009-1菌絲生長的影響

2.7 不同氮源對菌絲生長的影響

TF2009-1在供試的9種不同氮源培養(yǎng)液和不加氮源（CK）的培養(yǎng)液中均能生長，菌絲生物量存在顯著性差異。病原菌對酵母菌和蛋白胨的利用效果最好，菌絲生物量分別為6.795，6.168 mg/mL；對甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀、尿素和硝酸銨的利用效果較差，其生物量均小于1.235 mg/mL，且相互間無顯著性差異（圖9）。

圖9 不同氮源對TF2009-1菌絲生長的影響

表1 菌絲和分生孢子致死溫度測定

2.8 菌絲體及分生孢子致死溫度測定

TF2009-1菌絲塊在50℃水浴中處理10 min后其菌絲不能生長，說明菌絲的最低致死溫度為50℃水浴處理 10 min；分生孢子懸浮液在55℃水浴中處理10 min后，分生孢子不能萌發(fā)，說明分生孢子的最低致死溫度為55℃水浴處理10 min（表1）。

3 小結(jié)與討論

國內(nèi)外尚無C.eleocharidis生物學(xué)特性的相關(guān)報道。本次荸薺稈枯病菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，在連續(xù)光照、12 h光暗交替和連續(xù)黑暗條件下，病菌均能正常生長，且菌落平均直徑無顯著性差異；分生孢子在2%水瓊脂平板上均可萌發(fā)，且其萌發(fā)率無顯著性差異；該菌菌絲在PDA平板上培養(yǎng)時，在5～35℃內(nèi)其均能生長，最適溫度為25～30℃；分生孢子在2%水瓊脂平板上，于5～35℃內(nèi)均可萌發(fā)，最適溫度為25～30℃。據(jù)梁鈞等[3]和李清銑等[5]報道，從廣西和江蘇兩地荸薺稈枯病病莖上分離的荸薺柱盤孢生長溫度分別為8～ 32℃和5～32℃，最適溫度分別為25～30℃和23～29℃，其中李清銑等[5]還指出荸薺柱盤孢分生孢子的萌發(fā)溫度為10～32.5℃，最適溫度22～27.5℃。這與本研究結(jié)果基本一致，說明在中國南方和中部地區(qū)該菌對溫度的適應(yīng)能力差異不大。該菌在供試的8種培養(yǎng)液中均能生長，且菌絲生物量存在顯著性差異，在PDB中菌絲生物量最大，OMB中最小。該菌在供試的8種培養(yǎng)基中均能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量存在顯著差異，在MBA上產(chǎn)孢量最高，OMA、VA、PSA和PDA上最低。該菌菌絲在pH值為3.0～10.0的PDA培養(yǎng)基上均能生長，且菌落平均直徑存在顯著性差異，pH值為6.0～7.0時菌絲生長最快，pH值為11.0時菌絲不能生長。梁鈞等[3]報道，從廣西荸薺稈枯病病莖上分離的荸薺柱盤孢菌生長最適宜pH值為6.47；李清銑等[3]報道，從江蘇荸薺稈枯病病菌上分離的荸薺柱盤孢菌生長較適宜pH值為4.7～ 7.2，這與本研究結(jié)果基本一致，說明該菌較適宜在偏酸性環(huán)境中生長。

荸薺稈枯病菌能夠利用多種碳源和氮源，在無碳或無氮條件下也能生長，在不同碳源和氮源中菌絲生物量均存在顯著性差異。供試碳源中以蔗糖和淀粉的利用效果最好，D-甘露醇和D-半乳糖的利用次之，利用最差的是葡萄糖、L-山梨醇、麥芽糖、檸檬酸和果糖，但與CK相比無顯著性差異。供試氮源中以酵母膏和蛋白胨的利用效果最好，對甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀、尿素和硝酸銨的利用效果較差，與CK相比差異不顯著。李清銑等[5]報道荸薺稈枯病菌在不同碳源中對淀粉的利用效果最好，其次為果糖和乳糖，麥芽糖利用較差，蔗糖和葡萄糖的利用效果最差，病菌幾乎不能生長；氮源中以蛋白胨和天冬酰胺利用效果最好。梁鈞等[3]報道荸薺稈枯病菌在不同碳源中對葡萄糖、D-甘露醇和蔗糖的利用較好，麥芽糖次之；氮源中則以甘氨酸等的利用效果最好，硫酸銨、硝酸銨、尿素等的利用最差。這與本研究結(jié)果差異較大，推測可能是由于3個地方種植的荸薺品種不同，也可能是因?yàn)檩┧j稈枯病菌存在生態(tài)地理型差異。

荸薺稈枯病菌菌絲和分生孢子的最低致死溫度分別為50℃水浴處理10 min和55℃水浴處理10 min。病菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)受處理時間與處理溫度的影響，該試驗(yàn)結(jié)果為選擇適宜的處理溫度和時間，應(yīng)用熱處理法來控制荸薺稈枯病提供了參考。不同熱處理方法、時間和溫度對病原菌存活力的抑制作用還需要進(jìn)一步的研究。

[2]方中達(dá)．植病研究方法.3版[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2]黃彰欣．植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1993：56－59.

[3]梁鈞，賴傳雅．荸薺稈枯病菌生物學(xué)性狀研究[J]．廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，14（4）：288－294.

[4]Freeman S,Nizani Y,Dotan S,et al.Control ofColletotrichum acutatumin strawberry under laboratory,greenhouse,and field conditions[J].Plant Disease,1997,81:749-752.

[5]李清銑，王連榮.江蘇荸薺稈枯病的發(fā)生、危害及病原菌鑒定[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，1985（4）：20-22

Research on Biological Characteristic ofCylindrosporium eleocharidis

PAN Li,ZHU Zhixian,LV Rujing,ZHENG Lu,HUANG Junbin
(College of Plant Science Technology,Huazhong Agricultural University/Key Lab of Crop Disease Monitoring and Safety Control in Hubei Province,Wuhan 430070)

Biological characteristic ofCylindrosporium eleocharidisindicated that the range of temperature for mycelia growth and conidia germination both were 5-35℃,and the optimal range of temperature for both were 25-30℃;potato dextrose liquid medium (PDB)was the most favorable for mycelium growth,and mung bean agar medium (MBA)was the optimal for sporulation.The range of pH value for mycelia growth was 3-11,with the optimal pH value of 6-7.Among the tested carbon and nitrogen source in Czapek liquid medium,sucrose,amylum,yeast extract and peptone were the most favorable for mycelia growth.The lethal temperature for mycelia and conidia was 50℃,10 min and 55℃,10 min,respectively.This is the first report of biological characteristic ofC.eleocharidisin Hubei province,the causal agent of Chinese water chestnut stem blight.

Chinese water chestnut;Stem blight;Cylindrosporium eleocharidis;Biological

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.027

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（200903017）

黃俊斌（1963-），男，通信作者，教授，研究方向?yàn)橹参镎婢『εc分子植物病理學(xué)，E-mail：junbinhuang@mail.hzau.edu.cn

2011-07-05