羅海莉，李潔，嚴守雷，王清章

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢，430070）

蓮藕貯藏期主要致病真菌分離鑒定及其致病相關(guān)酶酶學(xué)特性研究

羅海莉，李潔，嚴守雷，王清章

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢，430070）

分別用組織分離法、直接挑取法和組織浸液劃線法對貯藏期患病蓮藕的病原菌進行分離，分離得到9種真菌，經(jīng)回接發(fā)現(xiàn)9種真菌均致病。再通過形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定9種真菌中有3種分別屬于青霉屬（Penicillium）、交鏈孢霉屬（Alternaria）和芽枝孢霉屬（Cladosporium），其他6種屬于鐮刀菌屬（Fusarium），其中1株可產(chǎn)生紅色素的鐮刀菌的致病能力最強。選擇產(chǎn)紅色素的致病性最強的鐮刀菌，通過測定活體外和活體內(nèi)的聚甲基半乳糖醛酸酶（PGM）和羧甲基纖維素酶（Cx）2種細胞壁降解酶活性的變化研究該病原菌的致病機理，結(jié)果顯示，在活體外，PMG的活性隨著培養(yǎng)時間延長先增加后降低最后到基本不變，而Cx活性則持續(xù)緩慢增加，即在前期主要是PMG起作用，后期則主要是Cx起作用；在活體內(nèi)，接菌的蓮藕的PMG和Cx活性顯著高于未接菌的藕（P＜0.05），說明PGM和Cx這2種細胞壁降解酶在病原菌的致病過程中起到了重要作用，是重要的致病因子。

蓮藕；腐爛；病原菌；鐮刀菌屬；聚甲基半乳糖醛酸酶；羧甲基纖維素酶

蓮藕是集果、蔬、藥為一體的優(yōu)質(zhì)蔬菜，具有很高的營養(yǎng)價值、藥用價值和經(jīng)濟價值。除鮮食外，還可作藕粉、蓮藕汁飲料、速凍藕片、脫水藕片、清水藕、鹽水藕、藕脯等加工制品[1]。近年來蓮藕的種植面積逐步增大，并以水煮藕、鹽漬藕、速凍藕和真空保鮮藕等形式出口到美國、日本和新加坡等國家[2]。但是蓮藕采挖后，暴露于空氣中易出現(xiàn)褐變、干縮、霉?fàn)€等現(xiàn)象，制約了蓮藕貯藏、運輸及出口銷售產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前針對蓮藕已經(jīng)開發(fā)出了系列抗褐變劑，結(jié)合涂膜、真空、低溫等保鮮技術(shù)可以較好地控制褐變，然而在低溫貯藏過程中霉變依然嚴重影響貯藏鮮藕的商品性。因此本研究對低溫貯藏條件下霉變的蓮藕，分離鑒定引起貯藏蓮藕霉變的主要病原微生物，從酶學(xué)角度分析主要致病菌的致病機理，為低溫貯藏條件下保持蓮藕的新鮮度和品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料取自2010年5～6月貯藏于4～10℃條件下，有典型的發(fā)霉或腐爛癥狀的蓮藕；人工回接蓮藕購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場，品種皆為鄂蓮5號（品種代號：3735）。CM304凍干血漿為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。氧化酶試劑由法國bios-Merieumx生產(chǎn)。

1.2 主要培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL[3]。

1.3 真菌的分離純化

為抑制細菌污染，先在200 mL PDA培養(yǎng)基中加入1 mL經(jīng)過濾除菌的100 mg/mL的頭孢霉素和2～3滴25%的乳酸，再倒平板。然后采用以下2種方法進行分離：①直接挑取霉菌菌絲接種到平板上，25℃倒置培養(yǎng)；②切取病健交界處組織，先用升汞消毒2～3 s，再用75%酒精消毒2 min，然后用無菌水沖洗，置于平板上，25℃倒置培養(yǎng)。待菌絲長出時，挑取菌絲移至另一平板培養(yǎng)，重復(fù)2～3次確保菌種純化，然后于4℃斜面保藏備用。

1.4 致病性檢測

取PDA平板上培養(yǎng)5～6 d的新鮮菌體，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌碟進行回接。將藕表面清洗干凈，用75%酒精擦拭消毒，并用無菌水沖洗3次，無菌操作臺上晾干。將以上制備的菌碟和菌液分別采用“刺傷”和“無傷”2種方式進行接種，每6個藕為1組，并以無菌水涂抹處理為對照。接種后將藕置于鋪有1層打濕的吸水紙的保鮮盒中，保鮮膜封口并用橡皮筋扎住周圍，置于4～10℃冰箱。待蓮藕發(fā)病后，對發(fā)病蓮藕進行病原菌的再分離。

1.5 病原真菌的鑒定

采用形態(tài)學(xué)方法鑒定。取滅菌的蓋玻片斜插在PDA平板上，再接上純化的菌種，25℃培養(yǎng)3～4 d。然后拔出蓋玻片，置于載玻片上于顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)，記錄觀察結(jié)果并拍照，菌絲體或孢子無色的菌先用棉藍進行染色，再拍照。根據(jù)菌落、孢子及孢子梗形態(tài)，參考《真菌鑒定手冊》[4]、《真菌學(xué)》[5]、《普通真菌學(xué)》[6]等將其鑒定到屬。

1.6 細胞壁降解酶的提取

①活體外病原菌細胞壁降解酶的培養(yǎng)及提取參考薛蓮等[7]和馮晶等[8]的方法，向改良的Czaper液體培養(yǎng)基中加入果膠或羧甲基纖維素鈉（CMC）作為碳源（果膠誘導(dǎo)產(chǎn)生果膠酶，CMC誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶），后分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝100 mL培養(yǎng)基。病菌在25℃培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取菌碟，每瓶培養(yǎng)基中加入3片菌碟，25℃振蕩培養(yǎng)，過濾除去菌絲，4℃下10 000 r/min離心25 min，取上清液作為待測酶液。

②采用乙醇—NaCl提取法提取病原菌感染后活體內(nèi)細胞壁降解酶[7，10]。

1.7 細胞壁降解酶活性的測定

聚甲基半乳糖醛酸酶（PGM）活性和羧甲基纖維素酶（Cx）活性均采用分光光度計法測定[9，10]。酶活單位為50℃下每1 min催化底物釋放1 μg還原糖所需酶量，酶活單位（U/g）=m×1 000/（30×0.5）。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2003軟件分析數(shù)據(jù)、繪制圖表。用SPSS 11.5進行方差（ANOVA）分析，用最小顯著差法（LSD）與S-N-K檢驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮藕貯藏期的發(fā)病癥狀

貯藏2周后蓮藕開始發(fā)病，表皮擦傷處和藕節(jié)處最先開始發(fā)粘，其后蓮藕表面擦傷處出現(xiàn)比較干燥的粉紅色粉末狀菌落，其顏色逐漸變褐變黑，表面出現(xiàn)青色、灰色和白色霉菌（圖1b），貯藏中后期發(fā)病嚴重的藕會出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象（圖1c），且黑色面積擴大，藕也出現(xiàn)嚴重皺縮。

圖1 新鮮蓮藕（a）與發(fā)病蓮藕（b，c）

2.2 分離的致病真菌

從9株發(fā)病較典型的病株上分離到60株霉菌，根據(jù)PDA平板上菌落的形態(tài)、顏色將霉菌歸為9種，真菌在PDA平板上的菌落形態(tài)見圖2。

圖2 蓮藕上分離到的真菌菌落形態(tài)

2.3 人工回接試驗

由試驗結(jié)果可知，9種霉菌回接后均可引起蓮藕發(fā)病，各菌主要通過傷口侵入，且侵入后發(fā)病率均較高。M4、M5、M8、M9這4種菌在蓮藕無傷的條件下也可使其發(fā)病，M4與M5的無傷發(fā)病率分別可達到60%，50%，此外，M4、M5有傷接種后的發(fā)病程度最嚴重，其中M4的發(fā)病率略高于M5。由此判斷，蓮藕貯藏期主要病原菌為霉菌，且M4的致病能力最強。

2.4 病原真菌鑒定

M1菌絲無色或淡色，有橫隔，分生孢子梗頂端有特殊的掃帚狀分支，分支為多極的分生孢子梗，最后產(chǎn)生許多瓶梗，瓶梗上著生分生孢子鏈，分生孢子呈球形，鑒定其屬青霉屬（Penicillium）。M2菌絲淡褐色，有隔膜，分生孢子梗較短，單生，不分枝，分生孢子深褐色，串生有分枝，呈紡錘狀或倒棒狀，頂端延長成喙?fàn)睿嗉毎?，有磚壁狀分隔，橫隔1～4個，縱隔0～3個，鑒定其屬交鏈孢霉屬（Alternaria）。M3分生孢子梗淡褐色，單生，有分支，分生孢子褐色，卵形至橢圓形，有鏈狀分支，鑒定其屬芽枝孢霉屬（Cladosporium），各菌孢子及孢子梗形態(tài)見圖3。M4、M5、M6、M7、M8、M9菌絲有隔，分枝，分生孢子為小型或大型，小型分生孢子卵圓形至柱形，有1～2個隔膜，大型分生孢子鐮刀形或長柱形，有較多隔膜，鑒定其屬鐮刀菌屬（Fusarium）。其中M4產(chǎn)紅色素，M5產(chǎn)黃色素，各菌孢子形態(tài)見圖4。

圖3 M1（青霉）、M2（交鏈孢霉）及M3（芽枝孢霉）的孢子梗及孢子的顯微形態(tài)（400×）

圖4 M4～M9（鐮刀菌）的孢子顯微形態(tài)（400×）

2.5 病原菌M4活體外細胞壁降解酶酶活的變化

由圖5可以看出，在離體條件下，聚甲基半乳糖醛酸酶的活性先迅速增大再降低，最后基本保持不變。第2天，其活性達到最大，之后則不斷下降，第5天開始基本不變，說明在培養(yǎng)基中以果膠作為碳源時，M4在前2 d可迅速產(chǎn)生聚甲基半乳糖醛酸酶，之后則可能由于果膠不斷被分解消耗或pH值不斷下降而導(dǎo)致聚甲基半乳糖醛酸酶活性下降。纖維素酶活隨著培養(yǎng)時間延長而不斷增加，與聚甲基半乳糖醛酸酶活相比，其增加速度比較緩慢。綜合得出，在誘導(dǎo)物存在的條件下，蓮藕貯藏期的病原菌具有產(chǎn)生聚甲基半乳糖醛酸酶和纖維素酶的能力。在病原菌培養(yǎng)過程中，細胞壁降解酶可持續(xù)產(chǎn)生，前期主要是PMG起作用，后期主要是Cx起作用。

2.6 病原菌活體內(nèi)細胞壁降解酶的活性

活體內(nèi)的細胞壁降解酶是在蓮藕接上致病菌后第21天進行測定的。由圖6可以看出，接有菌的蓮藕其聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）的活性分別為2.64，4.74 U/g，而未接菌的蓮藕其聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）的活性分別為1.83，3.45 U/g。經(jīng)T檢驗分析，接菌的蓮藕與未接菌的蓮藕相比較，其兩種酶活的差異均具有顯著性（P＜0.05）。由于病原菌侵染前期主要是果膠酶破壞胞間果膠物質(zhì)，此階段的果膠酶作用比纖維素酶大，在病原菌侵染后期，主要由纖維素酶降解細胞壁物質(zhì)[11]，因此在病菌侵染后其纖維素酶活會大于果膠酶酶活。

圖5 活體外聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）與羧甲基纖維素酶（CX）的活性隨培養(yǎng)時間的變化

圖6 活體內(nèi)聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（CX）的活性

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于蓮藕的研究主要集中在防褐變、產(chǎn)品工藝及多酚氧化酶、膳食纖維、酚類物質(zhì)、淀粉等成分的提取、結(jié)構(gòu)及功效研究方面；病害方面的研究主要是田間植株的腐敗病，包括病原菌的分離鑒定及其發(fā)病規(guī)律與防治的研究，各研究認為蓮藕腐敗病病原菌主要為尖鐮孢菌蓮?；?（F.oxysporumf.sp.nelumbicola）[12～14]，其次為串珠鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、周毛桿菌等[15]。其中，Chen等[16]將分離到的尖鐮孢菌蓮專化型（F.oxysporumf.sp.nelumbicola）人工接種到蓮藕上可引起蓮藕褐色壞疽。而對于蓮藕采后運輸貯藏期微生物病害方面的研究尚屬空白。

本研究選用湖北武漢地區(qū)的蓮藕品種鄂蓮5號（代號：3735）進行試驗，從病株中分離到9種霉菌，并依照柯赫氏法則證明9種霉菌均可致病，引起蓮藕發(fā)霉、變褐變黑及腐爛。通過形態(tài)學(xué)進一步鑒定，初步確定9種菌有3種分別屬于青霉屬（Penicillium）、交鏈孢霉屬（Alternaria）和芽枝孢霉屬（Cladosporium），其他6種屬于鐮刀菌屬（Fusarium），其中1株可產(chǎn)生紅色素的鐮刀菌，其致病能力最強。

由以上結(jié)果可知，鐮刀菌（Fusarium）為蓮藕貯藏期的優(yōu)勢病原菌，但對于這些鐮刀菌是否和前人研究的蓮藕腐敗病病原鐮刀菌一致，仍需要進一步的鑒定來確認，以為蓮藕低溫貯藏時的霉變腐爛控制提供理論基礎(chǔ)。

病原真菌在與植物長期進化和復(fù)雜的互作過程中，逐漸形成了對植物的寄生性和致病性。在環(huán)境條件適宜時，病原菌對寄主植物致病能力的大小取決于其所具有致病因子的多少和活性的大小，致病因子是病原真菌產(chǎn)生的對寄主植物有毒性的代謝產(chǎn)物，主要包括酶、毒素、激素及胞外多糖等其他致病物質(zhì)[17]。病原菌在寄生過程中產(chǎn)生的胞外酶有非常重要的作用，其中與致病性有關(guān)的酶是細胞壁降解酶。本試驗研究了聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）的致病作用，結(jié)果表明，在活體外，PMG活性隨著培養(yǎng)時間延長先增加后降低最后到基本不變，而Cx活性則緩慢持續(xù)增加，即在前期主要是PMG起作用，后期則主要是Cx起作用；在活體內(nèi)，接菌的蓮藕PMG和Cx活性顯著高于未接菌的藕（P＜0.05）。

在未接菌的蓮藕上，PMG和Cx皆有活性，但并未引起病變。這是因為：一方面，植物體內(nèi)的酶活必須超過一個閾值，才會引起病變，而健康的藕上所產(chǎn)生的PMG和Cx活性太低；另一方面，健康組織內(nèi)的小環(huán)境不利于自身的細胞壁降解酶產(chǎn)生致病作用，只有在病菌侵入后，各種細胞壁降解酶相互協(xié)調(diào)，才能發(fā)揮浸解的作用，引起病變[8]。

病原菌對植物的致病因子除了酶，還有毒素、激素等物質(zhì)，且活體外和活體內(nèi)的環(huán)境因素不同，病原菌在培養(yǎng)基上產(chǎn)生的酶可能和被侵染的寄主組織上的酶不一樣[18]，因此，關(guān)于蓮藕貯藏期病原菌的致病機理仍需進一步研究。

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Research on Isolation and Identification of Pathogens from Lotus Root during Storage and Properties of Pathogenic-related Enzymes

LUO Haili,LI Jie,YAN Shoulei,WANG Qingzhang
(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)

The pathogens of lotus root diseases during storage were isolated and identified.The results showed that there were 9 fungi.Artificial inoculation test indicated that the 9 fungi had pathogenicity.According to morphological characteristics,three fungi were identified asPenicillium,AlternariaandCladosporiumrespectively,the other six were defined asFusarium,and one strain of the Fusarium producing haematochrome has the strongest pathogenicity.The Fusarium strain producing haematochrome and having the strongest pathogenicity was evaluated the pathogenic mechanism by determination of PGM and Cx activity,the results showed thatin vitro,PMG activity was increased initially and then stepped down, and Cx activity increased in the period,which indicated that PMG mainly took effect at the previous period and Cx played an important role at the later stage.In vivo,PMG and Cx activities of lotus root inoculated pathogenic fungus were higher than the control(p＜0.05).Cell wall degrading enzyme played a significant role in the period of pathogen causing disease, and which was an important pathogenic factor.

Lotus;Rot;Pathogen;Fusarium;PMG;Cx

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.025

羅海莉（1984-），女，碩士，主要從事水生蔬菜貯藏保鮮研究

嚴守雷，通信作者，E-mail：yanshooulei1225@163.com

2011-07-15