吳景棟，劉生財(cái)，楊盛春，魏英輝，賴鐘雄，羅銀華，饒學(xué)雄，張銳，吳高杰

（1.福建建寧縣蓮籽科學(xué)研究所，354500；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所）

30份蓮種質(zhì)資源的RAPD遺傳多樣性分析

吳景棟1，劉生財(cái)2，楊盛春1，魏英輝1，賴鐘雄2，羅銀華1，饒學(xué)雄1，張銳2，吳高杰2

（1.福建建寧縣蓮籽科學(xué)研究所，354500；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所）

采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)30份蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行鑒定。篩選出14對(duì)有效引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共產(chǎn)生2 146條帶，其中有1 516條為多態(tài)性條帶，各對(duì)引物的平均多態(tài)性條帶為108.29條，擴(kuò)增條帶的多態(tài)率達(dá)70.64%。對(duì)所得到的30份蓮種質(zhì)資源的RAPD圖譜進(jìn)行組合和綜合分析，結(jié)果表明花蓮與子蓮的相似遺傳系數(shù)較高，說(shuō)明這兩種蓮之間親緣關(guān)系比較近。

蓮；遺傳資源；RAPD；親緣關(guān)系

蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）是歷史悠久的古老植物，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，根據(jù)不同用途分化為子蓮、花蓮和藕蓮3個(gè)類型[1，2]。由于蓮是常異花授粉植物，不同品種間的基因交流易通過(guò)昆蟲的授粉來(lái)完成，這就造成蓮品種間遺傳資源的混合和品種內(nèi)的遺傳變異較大，種質(zhì)高度雜合[3，4]，采用分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性鑒定是十分必要的。

近幾年來(lái)，利用分子標(biāo)記技術(shù)在分子水平上研究蓮的遺傳多樣性以及開展對(duì)蓮種質(zhì)資源保護(hù)的研究成為熱點(diǎn)。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、易操作等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，其在有效分析蓮的3大類型時(shí)是很有效的，還可以有效地發(fā)掘并利用蓮種質(zhì)資源中的特異基因，加快對(duì)蓮種質(zhì)資源的開發(fā)利用，提升蓮的價(jià)值[5]。本研究采用RAPD技術(shù)，對(duì)福建省建寧縣蓮籽科學(xué)研究所收集保存的30個(gè)蓮品種（系）進(jìn)行了初步分析，研究品種（系）之間的遺傳關(guān)系，了解這些品種（系）間的親緣關(guān)系，為蓮的分類、遺傳圖譜的構(gòu)建、DNA的指紋分析以及蓮的定向育種及種質(zhì)資源保存等打下基礎(chǔ)[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為30個(gè)蓮資源的嫩葉（均由福建省建寧縣蓮籽科學(xué)研究所提供），品種名稱見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

①蓮基因組DNA的提取 參照陳義挺等[7]，孔德政等[8]，李煥苓等[9]的方法提取，提取物于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 蓮品種的編號(hào)和名稱

②基因組DNA的檢測(cè) 以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析DNA的完整性。取8 μL DNA上樣，凝膠電泳，把膠塊放到EB染色液中染色10 min，再用清水漂洗，放在凝膠成像儀下觀察、拍照并保存。

③PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序 采用25 μL反應(yīng)體系，其中DNA模板1 μL（50 ng/μL），10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，隨機(jī)引物（10 mmol/L）l μL，Mg2+2.5 μL，無(wú)菌雙蒸水16.5 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min；94℃變性l min，38℃退火1 min，72℃延伸1 min，39個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，于4℃下保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用l×TAE電泳緩沖液，于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色。用GelDoc-It凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，記錄結(jié)果。

④RAPD反應(yīng)引物的篩選 本試驗(yàn)用形態(tài)差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的蓮（舒月、冬荷）DNA為模板，對(duì)上海Sangon生物工程公司生產(chǎn)的200個(gè)RAPD引物中隨機(jī)挑選的48個(gè)隨機(jī)引物（10 bp的寡聚核苷酸）進(jìn)行篩選。

⑤數(shù)據(jù)分析方法[10]a.條帶的記錄。根據(jù)同一引物在相同電泳遷移位置的有無(wú)統(tǒng)計(jì)譜帶，有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)，構(gòu)建0，1矩陣。b.數(shù)據(jù)分析和處理方法。利用SPSS V13.0軟件對(duì)30份蓮資源進(jìn)行聚類分析，建立遺傳關(guān)系聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮基因組DNA的提取質(zhì)量

30份蓮種質(zhì)資源基因組總DNA經(jīng)瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示，基因組DNA電泳得到的條帶，比較整齊、清晰，分子量較大且基本無(wú)降解、斷裂，完整性好。另外，由圖1可見(jiàn)，DNA電泳后呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶，但有少數(shù)彌散的熒光區(qū)出現(xiàn)，表明所提取的DNA樣品有少量的糖和RNA污染；從電泳圖譜中可知，所提DNA可以用于RAPD擴(kuò)增。

圖1 蓮基因組總DNA瓊脂糖電泳圖譜

2.2 RAPD引物篩選

選擇多態(tài)性好、條帶清晰且穩(wěn)定的14條引物作進(jìn)一步分析。14條引物分別是：S107、S134、S158、S175、S70、S101、S102、S115、S142、S140、S160、S118、S138、S179（表2）。

表2 不同引物對(duì)30份蓮種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增位點(diǎn)分析

2.3 30份蓮的RAPD多態(tài)性分析

本研究選用14條引物對(duì)30份蓮DNA基因組進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，獲得了不同基因組DNA擴(kuò)增圖譜。從表2和擴(kuò)增結(jié)果電泳圖（圖2）可以看出，14個(gè)隨機(jī)引物對(duì)30份蓮的擴(kuò)增共產(chǎn)生2 146條清晰且重復(fù)性較好的條帶，不同引物獲得的擴(kuò)增帶為59～226條，每個(gè)引物平均擴(kuò)增條帶數(shù)為153.29條；其中有1 516條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶為108.29條，擴(kuò)增條帶的多態(tài)率達(dá)70.64%。

圖2 部分引物的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 30份蓮RAPD的聚類分析

根據(jù)RAPD擴(kuò)增結(jié)果，統(tǒng)計(jì)得到的譜帶，建立遺傳相似矩陣，利用SPSS V13.0軟件的Withingrouplinkage和Jaccard對(duì)30份蓮資源進(jìn)行分析，獲得Jaccard相似系數(shù)表，結(jié)果如表3所示。花蓮與子蓮的相似遺傳系數(shù)比較高，這說(shuō)明2種蓮之間的親緣關(guān)系比較近。

根據(jù)歐氏距離（ED）法計(jì)算各樣品間的遺傳距離，利用SPSS V13.0軟件的Within-grouplinkage和Jaccard對(duì)30份蓮資源進(jìn)行分析，建立遺傳關(guān)系聚類樹狀圖（圖3），進(jìn)一步揭示了30份蓮資源間的親緣關(guān)系。從聚類圖上明顯可以看出，當(dāng)遺傳距離D= 15.00時(shí)，30份蓮種質(zhì)分為3大組：第1組為3，4；第2組為5，16，17；其余25個(gè)品種為1組。當(dāng)遺傳距離D=13.00時(shí)，可把30份建蓮種質(zhì)分為5組：第1組為3，4；第2組，5（冬瓜蓮）單獨(dú)為1組；第3組為16，17；第4組為25，26，27，28，29，30；其余19個(gè)品種為第5組。當(dāng)遺傳距離D=7.50時(shí)，30份蓮種質(zhì)可分為14組。

表3 30份蓮種質(zhì)資源分子標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)

3 結(jié)論與討論

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但RAPD技術(shù)是由多種微量成分參加的生化反應(yīng)，反應(yīng)十分靈敏，反應(yīng)體系及條件稍有變化，便會(huì)對(duì)其結(jié)果產(chǎn)生影響，因其影響因素較多，所以結(jié)果會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性差等問(wèn)題[9，11，12]。

圖3 30份建蓮資源的聚類分析

而RAPD技術(shù)在分析花蓮、子蓮、藕蓮時(shí)是很有效的[5]，因此本研究采用該技術(shù)對(duì)30份蓮種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定分析是可行的。在研究中發(fā)現(xiàn)，子蓮和花蓮可以歸類為一個(gè)聚群，其原因可能是由于子蓮與花蓮之間的遺傳距離較近的原因。蓮是常異花授粉植物，不同品種間的基因交流很容易通過(guò)昆蟲的授粉來(lái)完成，這就造成品種間遺傳資源的混合和品種內(nèi)的遺傳變異較大。本研究也發(fā)現(xiàn)，即使是同一地區(qū)的不同品種間也會(huì)有很大差別[13]。

RAPD技術(shù)的應(yīng)用使在DNA分子水平上研究蓮資源遺傳多樣性成為可能，對(duì)分析蓮不同品種的系譜關(guān)系、親緣品種群間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系及分類地位等方面都起著重要的作用。

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Analysis on Genetic Diversity of 30 Lotus(Nelumbo nuciferaGaertn.) Germplasm Resources by RAPD Maker

WU Jingdong1,LIU Shengcai2,YANG Shengchun1,LAI Zhongxiong2,WEI Yinghui1,LUO Yinhua1, RAO Xuexiong1,ZHANG Rui2,WU Gaojie2
(1.Research Institute of Seed Lotus,Jianning County,Fujian 354500; 2.Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University)

Genetic diversity of 30 lotus germeplasms was analyzed by RAPD marker.14 pair primers were adopted to analyze polymorphism in RAPD amplification,with 2 146 RAPD bands obtained.1 516 were polymorphic bands,with average polymorphic bands of 108.29 per pair of primers,covering 70.64%of the total bands.The RAPD map of 30 lotus germplasm resources was combined and comprehensively analyzed.The results showed that the genetic similarity coefficient between flower lotus and seed lotus was relatively high,indicating their close genetic relationship.

Lotus;Germplasm resources;RAPD;Genetic relations

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.017

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

吳景棟（1972-），男，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)樽由徲N和栽培，電話：0598-3960965，E-mail：wjd3960965@126.com

賴鐘雄（1966-），男，通信作者，博士，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向?yàn)閳@藝植物生物技術(shù)與遺傳資源，電話：0591-83789484，E-mail：Laizx01@163.com

2011-07-15