沈小婷，趙雪濤

上海市徐匯區(qū)疾病預防控制中心，上海 200237

霍亂弧菌(Vibriocholerae)是烈性腸道傳染病霍亂的病原體，可導致感染者劇烈嘔吐、嚴重腹瀉、失水乃至死亡?；魜y是一種流行廣泛的烈性傳染病，在世界范圍出現(xiàn)多次大流行，病死率甚高?；魜y弧菌的快速、準確檢測是制定霍亂預防、控制政策的重要依據(jù)。國內、外對霍亂弧菌進行了大量研究，建立了許多有效的檢測方法，其中傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)、生化檢測、血清學分型及噬菌體分型已廣泛應用，并作為常規(guī)檢測手段。近年來，分子生物學技術以其高敏感度、高特異度，操作簡便、迅速等優(yōu)點越來越多應用于霍亂弧菌的檢測及分型研究。本文就近年來國內、外對霍亂弧菌檢測方法的研究進展進行綜述。

1 傳統(tǒng)檢測方法

霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，常以堿性蛋白胨水作為其選擇性增菌培養(yǎng)基?；魜y弧菌在堿性蛋白胨水中生長迅速，可將標本在37 ℃培養(yǎng)6～8 h后取上層培養(yǎng)物做弧菌分離?；魜y弧菌在營養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上呈無色、圓形、透明、光滑、濕潤、扁平或稍凸起、邊緣整齊的菌落。為便于檢出，根據(jù)其生長特性、對某些抗生素的敏感性及與其他常見腸道菌的差別，國內已研制出慶大霉素瓊脂、四號瓊脂，國外有TCBS等選擇性培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基一般都含有膽鹽、亞碲酸鉀、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。在不同的選擇性培養(yǎng)基上，霍亂弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需進行一系列生化反應、血清凝集等試驗，對結果進行綜合判定，從而確定為霍亂弧菌[1,2]。目前，細菌培養(yǎng)、生化和血清學鑒定仍是霍亂弧菌實驗室診斷的“金標準”，具有較好的敏感度和特異度。但不可否認，傳統(tǒng)方法檢測周期長、工作量大，且易受環(huán)境、培養(yǎng)條件及主觀因素影響，不能滿足疾病預防和控制快速反應體系的需求，不利于實驗室的快速診斷。

2 分子生物學方法

2.1 聚合酶鏈反應

2.1.1普通聚合酶鏈反應運用常規(guī)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測霍亂弧菌，一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因[3,4]。一些非產毒株(如環(huán)境來源的菌株)有可能通過基因水平轉移獲得毒力基因成為產毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調節(jié)菌毛A基因 (tcpA)、O抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達調控基因(toxR)等也被選用為PCR的靶基因[5,6]，這大大提高了檢測的特異度。PCR方法檢測霍亂弧菌的特異度和敏感度都很高，但其本身也有缺點：一是因樣本DNA交叉污染而出現(xiàn)假陽性；二是由于待測樣本中的某些雜質蛋白及核酸提取過程中用到乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、SDS等，如未去除干凈就會成為TaqDNA聚合酶的抑制劑，造成擴增失敗。此外，標本中也可能含有會降解靶核酸的核酸酶，導致假陰性結果。因此，在運用PCR檢測霍亂弧菌時，要注意避免DNA污染以及其他雜質的干擾。

2.1.2多重PCR與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應可檢測多個基因，節(jié)省了時間和成本。國內、外許多學者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進行組合[7]，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PCR同時可準確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測效率。

Tarr等[8]運用多重PCR技術同時檢測霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的sodB、副溶血弧菌的flaE、創(chuàng)傷弧菌的hsp等基因，Gómez-Duarte等[9]運用多重PCR從腹瀉患者的臨床標本中同時檢測到包括霍亂弧菌在內的7種腸道致病菌。這些都大大提高了感染性腹瀉病原學診斷的效率和水平，為多種致病菌的快速診斷提供了很好的思路和方法。多重PCR的引物設計要注意避免各對引物之間的相互干擾和各目的片段之間的非特異性擴增。

2.1.3熒光定量PCR熒光定量PCR自動化程度高、特異性強、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設計更精確、多通道熒光PCR儀的開發(fā)與廣泛使用，多重熒光定量PCR技術日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點而廣泛應用于病毒、細菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應用的熱點。Huang等[10]選取O1和O139群特異的rbf基因以及ctxA、hylA等作為靶點，建立了四重熒光定量PCR體系，不僅克服了單重熒光定量PCR僅檢測毒力基因特異度不高而造成假陽性的缺點，而且能很好檢測并區(qū)分O1群和O139群霍亂弧菌及其毒力株，最低檢出限達每個反應2個菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。這與單重熒光定量PCR的最低檢出限相當，降低了檢測成本，提高了檢測效率。Fykse等[11]運用基于分子信號標記的多重熒光定量PCR體系檢測環(huán)境標本中霍亂弧菌的ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多個基因的不同組合，在一定程度上削弱了標本中雜質的干擾，提高了PCR技術對環(huán)境標本檢測的特異度，敏感度也較TaqMan探針和SYBR Green I方法提高了100倍?？梢?，多重熒光定量PCR技術已成為未來檢測技術發(fā)展的趨勢，但必須保證不同探針所標記的熒光基團間無相互干擾，且各目的片段有相近的擴增效率。

2.2 基因芯片

與PCR方法相比，基因芯片技術能同時獲得更多病原學、生物學方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運用基因芯片技術對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進行全面分析，對掌握這些細菌的致病性及進行有效預防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應用尚需時間等待。

2.3 環(huán)介導恒溫擴增技術

環(huán)介導恒溫擴增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是2000年Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。此方法針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(60～65 ℃)孵育40～60 min，引發(fā)自動鏈循環(huán)取代反應，完成對靶基因的擴增。擴增產物可通過電泳或直接通過副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行檢測。Yamazaki等[13]采用LAMP檢測霍亂弧菌的ctxA基因，最低檢測限達每個反應1.4 CFU，比普通PCR高近10倍，說明該方法具有很高的靈敏度。

3 免疫學方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)一般不需要分離即可直接對樣品進行檢測，操作簡便。國內、外已有許多學者制備了針對O1群、O139群霍亂弧菌的單克隆抗體，特異性檢測這2種細菌。Tuteja等[14]用含有ctxB和ompW片段的重組蛋白免疫小鼠，制備了分別針對這2種抗原的單克隆抗體；同時檢測并區(qū)分了臨床及環(huán)境標本中霍亂弧菌的產毒株和非產毒株，其檢出限達102CFU/ml，大大提高了此類方法的特異度和敏感度。

3.2 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術具有簡單、快捷、易于判讀結果的優(yōu)點，已有多種商品化的O1群、O139群霍亂弧菌快速檢測試紙條，廣泛應用于該菌的臨床檢測。但其檢測靈敏度和特異度較差。Mukherjee等[15]應用Dipstick Kit檢測O1群、O139群霍亂弧菌，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法比較，具有更高的靈敏度和特異度。

4 結語

采用分子生物學技術研究霍亂及其流行病學特征，可從分子水平闡明霍亂發(fā)生、發(fā)展、分布等規(guī)律，為霍亂弧菌的檢測和研究提供更多的思路和方法，逐漸成為未來檢測技術的發(fā)展趨勢。但有些新技術的應用至今仍然存在一定障礙，如PCR技術本身的缺陷造成假陽性或假陰性結果，引物設計、操作技巧等也造成其應用上的缺陷；再如基因芯片從研究走向臨床，關鍵的技術問題(簡化樣品制備和標記技術、增強檢測信號靈敏度、提高芯片檢測特異度、芯片檢測全過程自動化及降低檢測成本等)不可回避。應將傳統(tǒng)的微生物檢測技術與分子生物學技術聯(lián)合應用于病原微生物的檢測和研究，尤其是當發(fā)現(xiàn)未知病原體時，需借助微生物學、免疫學和分子生物學等方法確定病原體，只有這樣才能真正提高病原微生物的檢測和研究能力。

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