別良玉,張偉杰,任川川,王 琳,孫 楨,杜雅冰,王 生,樊青霞#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)腫瘤中心鄭州 450052 3)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室鄭州 450052 4)許昌市中心醫(yī)院腫瘤科許昌 461000

#通訊作者,女,1952年6月生,教授,研究方向:食管癌內(nèi)科綜合治療,E-mail:fqx2243@yahoo.com.cn

Pim激酶是一個與哺乳動物蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶密切相關(guān)的家族[1],研究[2]發(fā)現(xiàn) Pim激酶家族能使促凋亡分子Bad發(fā)生磷酸化而失活,同時使抗凋亡家族Bcl-XL、Bcl-2的表達(dá)增加,導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。Pim家族有3個成員,Pim-1、Pim-2和Pim-3,目前Pim-3在腫瘤發(fā)生中的研究主要集中在尤文肉瘤、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌及胃癌等。微小染色體(minichromosomemantenance,MCM)是影響染色體有絲分裂穩(wěn)定性的主要基因,其編碼的MCM蛋白家族與DNA復(fù)制的啟動密切相關(guān)。MCM7為MCM的關(guān)鍵成員,在控制DNA復(fù)制的起始過程中起關(guān)鍵作用[3]。作者采用免疫組化SP法檢測食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織中Pim-3和MCM7蛋白的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床病理特征,探討二者在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集2008年 11月至2009年1月安陽市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮食管癌標(biāo)本 77例。77例中男51例,女26例,年齡44～78歲,中位年齡 61歲,全部病例經(jīng)病理證實均為鱗狀細(xì)胞癌。腫瘤大小1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm～8.0 cm×8.0 cm× 2.0 cm;發(fā)生部位:胸上段12例,胸中段51例,胸下段14例;大體病理形態(tài):潰瘍型 33例,髓質(zhì)型 34例,縮窄型7例,蕈傘型3例;組織學(xué)分級:高中分化癌 41例,低分化癌 36例;腫瘤侵及外膜 56例,未侵及外膜 21例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 39例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)與美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)2009年聯(lián)合出版的食管癌國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第 7版)[4],Ⅰ、Ⅱ期 48例,Ⅲ、Ⅳ期 29例。另取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 2009年 7月至2009年 10月存檔的距癌組織邊緣1.0～1.5 cm處癌旁中重度不典型增生組織 70例,距癌組織邊緣 ＞5 cm處正常食管黏膜組織 46例。所有患者術(shù)前均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療,術(shù)后病理檢測其切緣均為陰性,所有患者臨床病理資料均完整。

1.2 主要試劑 兔抗人 Pim-3多克隆抗體(ab71321,Abcam公司)和鼠抗人MCM 7單克隆抗體(SC-9966,Santa Cruz公司)。DAB顯色劑和SP-9000免疫組化檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 Pim-3和MCM 7蛋白表達(dá)的免疫組化檢測將獲得的全部標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為 10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片。按試劑盒說明書的步驟操作,一抗工作濃度均為 1∶100。用已知陽性切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。采用雙盲法進(jìn)行結(jié)果判定,每張切片由 2名病理科醫(yī)師分別判斷,二者結(jié)果不一致時重新判斷。①Pim-3蛋白陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色著色,每張切片選取 5個具有代表性的高倍視野,計數(shù)500個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。依據(jù)文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn),按陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行分級:＜25%為 -,25%～為+,51%～為■,＞75%為■。②MCM7蛋白陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核棕黃、棕褐色顆粒狀著色。按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分級:染色與背景相似者為 0分,著色淺、略高于背景者為 1分,中度著色、明顯高于背景者為 2分,強(qiáng)染、著深棕色者為 3分;陽性細(xì)胞數(shù)百分率 ＜10%為 0分,10%～為 1分, 51%～為 2分,＞75%為 3分。兩項評分相加:0～1分為 -,2分為 +為,3～4分為■,≥5分為■。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析,3種食管組織、不同臨床病理特征ESCC組織間Pim-3和MCM7蛋白表達(dá)水平的比較采用秩和檢驗;對ESCC組織中Pim-3和MCM 7蛋白的表達(dá)進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種組織中Pim-3和MCM 7蛋白的表達(dá) 見圖1和表1。

圖1 不同食管組織中Pim-3(A)和MCM 7(B)蛋白的表達(dá)(SP,×400)

表1 ESCC、癌旁不典型增生和正常食管組織中Pim-3和MCM 7蛋白的表達(dá)

2.2 Pim-3和MCM 7蛋白的表達(dá)與ESCC患者臨 床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 ESCC組織中Pim-3和MCM 7蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ESCC組織中Pim-3和MCM 7蛋白表達(dá)的相關(guān)性 見表3。

表3 ESCC組織中Pim-3與M CM 7蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

中國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家,全世界每年新診斷的 30萬食管癌患者中半數(shù)以上是在中國(16.72萬)[6]。河南省,特別是河南北部的林州市(原林縣)、安陽、輝縣等地是食管癌發(fā)病率和病死率最高的地區(qū)[7]。早期診斷對食管癌的預(yù)后意義重大,然而目前尚無特異性的腫瘤標(biāo)志物,因此迫切需要尋找特異性的食管癌分子指標(biāo)。

Fujii等[8]發(fā)現(xiàn),Pim-3蛋白在高分化肝細(xì)胞癌細(xì)胞胞質(zhì)呈弱陽性表達(dá),在肝臟再生膽管中亦有表達(dá),而在正常肝組織中不表達(dá)。Li等[9]發(fā)現(xiàn) Pim-3蛋白在人胰腺癌組織中異常表達(dá),但在正常胰腺組織中不表達(dá)。Popivanova等[2]在人結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)Pim-3蛋白在高中分化的結(jié)腸癌組織中有表達(dá),而在低分化結(jié)腸癌組織中無表達(dá)。

作者的研究結(jié)果顯示ESCC組織中Pim-3蛋白的表達(dá)水平高于癌旁中重度不典型增生組織及正常食管黏膜組織,Ⅲ、Ⅳ期ESCC組織中的表達(dá)水平高于Ⅰ、Ⅱ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。推測Pim-3的異常表達(dá)在ESCC的發(fā)生過程中有一定作用,可能成為判斷ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的一個指標(biāo)。Zheng等[10]研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌組織中Pim-3蛋白過度表達(dá)的患者生存期明顯縮短,認(rèn)為 Pim-3可能是胃癌一個獨立的預(yù)后因子。作者的隨訪研究尚在進(jìn)行中。

MCM家族被認(rèn)為是啟動DNA復(fù)制的關(guān)鍵因子[3]。MCM蛋白的表達(dá)在 G1/S轉(zhuǎn)換達(dá)峰值,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G0期和分化、衰老時,MCM表達(dá)水平下降甚至檢測不到。因而MCM蛋白已被提出作為一個新的生物學(xué)標(biāo)記用來檢測“伴有生長潛能”的 G1期細(xì)胞[11]。

作者的研究結(jié)果顯示,在正常食管黏膜上皮中MCM7蛋白表達(dá)多局限在基底層,表明基底層及其臨近細(xì)胞具有一定的分裂增殖能力。在由正常食管黏膜向中重度不典型增生、癌變發(fā)展的過程中, MCM7蛋白表達(dá)逐漸升高,說明隨著食管黏膜由正常向癌轉(zhuǎn)變,越來越多的細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。MCM7蛋白的表達(dá)還與食管癌的分化程度和有無外膜浸潤有關(guān),這與 Ren等[12]在前列腺癌、任占平等[13]在乳癌組織中的研究結(jié)果一致。推測可能與MCM7蛋白高表達(dá)導(dǎo)致 G1期阻滯、S期復(fù)制起始準(zhǔn)許調(diào)控精確功能的喪失,使得受損的食管鱗狀上皮細(xì)胞在DNA損傷的狀況下繞過完整的細(xì)胞周期有關(guān)。MCM7表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖程度有關(guān),可以體現(xiàn)腫瘤的惡性程度,提示可以進(jìn)一步研究MCM 7與ESCC預(yù)后的關(guān)系。

該研究結(jié)果還顯示ESCC組織中Pim-3與MCM7蛋白的表達(dá)無明顯相關(guān)性,其真正的原因有待進(jìn)一步研究。

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