章金濤,張明昊,王純耀

1)鄭州大學(xué)實驗動物中心鄭州 450052 2)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心鄭州 450008

△男,1968年 9月生,博士,教授,研究方向:分子遺傳學(xué),E-mail:jtzhang@zzu.edu.cn

豫醫(yī)卷毛大鼠表皮生長因子受體基因的比較生物學(xué)分析＊

章金濤1)△,張明昊2),王純耀1)

1)鄭州大學(xué)實驗動物中心鄭州 450052 2)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心鄭州 450008

△男,1968年 9月生,博士,教授,研究方向:分子遺傳學(xué),E-mail:jtzhang@zzu.edu.cn

卷毛大鼠;表皮生長因子受體;同源性比較

目的:比較豫醫(yī)卷毛大鼠與其他物種間表皮生長因子受體 (EGFR)基因及其編碼蛋白的序列差異。方法:采用 RT-PCR方法對豫醫(yī)卷毛大鼠 EGFR cDNA序列進(jìn)行克隆、測序,并借助生物信息技術(shù)對BN大鼠、家鼠、黃牛、獼猴和人 EGFR基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)遺傳學(xué)分析。結(jié)果:獲得了豫醫(yī)卷毛大鼠 EGFR基因全長 4 127 bp的 cDNA序列 (GenBank登錄號:HM801041)。豫醫(yī)卷毛大鼠與大鼠、小鼠、牛、猴和人等 5個物種 EGFR基因編碼區(qū)的核苷酸序列同源性分別為 99.5%、93.1%、81.6%、83.3%和83.6%,其編碼蛋白的氨基酸序列同源性分別是 99.8%、96.1%、87.4%、89.2%和 90.9%。結(jié)論:EGFR基因在進(jìn)化過程中是一個高度保守并具有重要功能的“持家基因”。

表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶家族,廣泛存在于成熟組織中,參與調(diào)控細(xì)胞代謝、增殖、遷移和分化等生理過程[1]。卷毛突變是一種被毛和觸須均發(fā)生彎曲的基因突變,如 wave-1、wave-2、cub和 s wh等[2-7],其中wave-2是 EGFR基因的點突變[3-5],突變的結(jié)果導(dǎo)致 EGFR蛋白的酪氨酸激酶活性下降。有些卷毛突變還具有一因多效性,伴發(fā)皮脂腺、乳腺、心臟和骨骼等發(fā)育異常,這些突變模型為研究毛發(fā)發(fā)育、組織分化、生長調(diào)節(jié)以及心臟等器官的疾病提供了較有價值的實驗材料[8]。豫醫(yī)卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat,YCHR)是 2006年 1月在SD大鼠種群中新發(fā)現(xiàn)的一種自發(fā)性突變動物,其卷毛性狀受常染色體上單一顯性基因控制,呈半顯性遺傳[9]。為深入研究 YCHR和其他物種 EGFR基因的同源性,作者克隆了 YCHR EGFR基因的cDNA序列,并與 GenBank上發(fā)布的其他物種的 EGFR基因編碼序列進(jìn)行了同源性比較,旨在進(jìn)一步探討哺乳動物 EGFR基因的同源性及其比較生物學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡 YCHR 10只,雌雄各半,來自河南省實驗動物中心,一級環(huán)境條件下飼養(yǎng)。

1.2 EGFR cDNA的擴(kuò)增與測序 ①RNA的提取及處理:處死大鼠后立即取腦組織,用UN I Q-10柱總 RNA抽提試劑盒 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取總 RNA,保存于 -80℃冰箱中待用。②引物設(shè)計:參考大鼠 EGFR基因 cDNA序列(GenBank登錄號:NM031507),用DNASTAR軟件的 PrimerSelect程序分別設(shè)計 6對重疊引物 (表1)。③擴(kuò)增與測序:取適量的總 RNA,用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行 RT-PCR。反應(yīng)條件:50℃反轉(zhuǎn)錄 30 min;94℃預(yù)變性 2 min;94℃變性 45 s,Tm(表 1)退火 30 s,72℃延伸 1 min,共進(jìn)行 35個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.3 EGFR cDNA序列和氨基酸序列分析 拼接YCHR EGFR cDNA的完整序列,并從美國國立生物信息中心 http://www.ncbi.nl m.nih.gov下載相關(guān)物種(BN大鼠、家鼠、黃牛、獼猴和人)EGFR cDNA序列,采用DNASTAR軟件和DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比較與系統(tǒng)遺傳學(xué)分析。

表1 EGFR基因cDNA擴(kuò)增所用引物信息

2 結(jié)果

2.1 YCHR EGFR cDNA的克隆 RT-PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖 1)。序列拼接示 YCHR EGFR cDNA全長序列為 4 127 bp(GenBank登錄號:HM801041)。

2.2 EGFR基因的比較生物學(xué)分析 結(jié)果見表 2、3。系統(tǒng)遺傳分析結(jié)果見圖 2。EGFR基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,YCHR與其他大鼠同在一個進(jìn)化分支,大鼠與小鼠親緣關(guān)系也比較近,與牛、猴和人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但其同源性≥80%。

圖1 EGFR cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 YCHR與其他物種EGFR基因編碼區(qū)核苷酸序列的同源性比較 %

表3 YCHR與其他物種EGFR氨基酸序列的同源性比較 %

圖2 EGFR基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

作者對不同物種來源的 EGFR cDNA序列及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列的同源性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)YCHR EGFR cDNA序列與其他 5個物種的同源性在 81.6%～99.5%,該基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列的同源性在 87.4%～99.8%,表明該基因在進(jìn)化過程中是一個高度保守并具有重要功能的“持家基因”,其編碼蛋白在不同物種中可能具有相同的結(jié)構(gòu)域。近年來有報道[10]指出,某些高度保守的單分子系統(tǒng)進(jìn)化研究是相應(yīng)物種基因組水平研究的重要證據(jù)和線索,因為對它的分析更能簡便有效地揭示出某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。就 EGFR基因及其編碼蛋白而言,人類與模式生物之間存在著一定的序列與功能的異同,因此,可以利用這一特點,把其他物種來源的 EGFR基因作為人 EGFR基因天然存在的“突變體”,從而進(jìn)一步揭示其結(jié)構(gòu)與功能的特性本質(zhì)。

綜上所述,作者獲得了 YCHR EGFR cDNA全長序列,初步了解了 EGFR基因在物種進(jìn)化上的同源性與保守性,為今后開展 EGFR基因與毛發(fā)生長、皮膚及腫瘤等方面的分子遺傳學(xué)研究積累了基礎(chǔ)資料。

[1]柏素云,王蔚林,李冠武,等.EGFR-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤[J].腫瘤防治雜志,2004,11(9):989

[2]Luetteke NC,Qiu TH,Peiffer RL,et al.TGF alpha deficiency results in hair follicle and eye abnormalities in targeted and waved-1 mice[J].Cell,1993,73(2):263

[3]LuettekeNC,PhillipsHK,Qiu TH,et al.Themousewaved-2 phenotype results from a point mutation in the EGF receptor tyrosine kinase[J].GenesDev,1994,8(4):399

[4]SibiliaM,WagnerB,HoebertzA,et al.Mice humanised for the EGF receptor display hypomorphic phenotypes in skin, bone and heart[J].Development,2003,130(19):4515

[5]Fowler KJ,Walker F,AlexanderW,et al.A mutation in the epidermal growth factor receptor in waved-2 mice has a profound effecton receptor biochemistry that results in impaired lactation[J].Proc NatlAcad SciUSA,1995,92(5):1465

[6]Johnson KR,Lane PW,Cook SA,et al.Curly bare(cub),a new mouse mutation on chromosome 11 causing skin and hair abnormalities,and a modifier gene(mcub)on chromosome 5[J].Genomics,2003,81(1):6

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[8]Sundberg JP,KingLE Jr.Mouse mutations as animalmodels and biomedical tools for dermatological research[J].J InvestDermatol,1996,106(2):368

[9]章金濤,杜春燕,王純耀,等.豫醫(yī)卷毛大鼠的遺傳特性[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2007,42(4):626

[10]孫大慶,姜毓君,韓希妍,等.牛凝乳酶原基因克隆及序列的進(jìn)化分析[J].遺傳,2008,30(7):863

Comparative biology analysis of EGFR gene in Yuyi curly hair rats

ZHANG Jintao1),ZHANG M inghao2),WANG Chunyao1)1)Laboratory Anim al Center,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500522)M edical Experim ental Teaching Center,School of B asicM edicine,Henan College of Traditional ChineseM edicine,Zhengzhou 450008

curly hair rat;epidermal growth factor receptor;homology comparison

Ai m:To study the difference of epidermal growth factor receptor(EGFR)gene and its coding protein between Yuyi curly hair rats and others species.Methods:RT-PCR technique was developed to clone and analyze the sequence of cDNA in EGFR gene from Yuyi curly hair rats,and biologic character of amino acid sequence encoding EGFR gene in different species(Norway rats,house mice,cattle,rhesus monkeys,and human).Results:A full-length cDNA of Yuyi curly hair rats was 4 127 bp(Accession Number:HM801041).The identities of nucleotide of EGFR gene were 99.5%,93.1%,81.6%,83.3%,and 83.6%by homologous comparison among Yuyi curly hair rats and Nor way rats, house mice,cattle,rhesus monkeys,and human,and those of amino acid sequences were 99.8%,96.1%,87.4%, 89.2%,and 90.9%,respectively.Conclusi on:EGFR gene is a highly-conserved gene and important housekeeping gene.

Q953

(2010-07-27收稿 責(zé)任編輯徐春燕)