程 勇,張謝夫,趙春臨,蔣志強

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科鄭州 450052

#通訊作者,男,1957年 3月生,本科,教授,研究方向:普外科基礎(chǔ)與臨床,E-mail:zhangxiefu@medmail.com.cn

信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3是一種潛在的細(xì)胞質(zhì)中固有的被JAK磷酸化調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子,能夠直接或間接地上調(diào)腫瘤細(xì)胞中調(diào)控增殖和生存的基因的表達(dá)。JAK/STAT是重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等重要過程。STAT3在各種腫瘤細(xì)胞系中持續(xù)高表達(dá),如血液和上皮惡性腫瘤,包括乳癌、頭頸部腫瘤、肺癌、卵巢癌和前列腺癌[1]。信號傳導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)3被證實是一種細(xì)胞信號因子的抑制因子,通過不同的機制對JAK-STAT通路進(jìn)行抑制調(diào)節(jié)[1]。該研究采用RT-PCR技術(shù)檢測SOCS3和STAT3mRNA在胃癌組織中的表達(dá)情況,探討兩者在胃癌發(fā)生中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集 2009年 9月至 2010年3月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除新鮮胃癌標(biāo)本,液氮保存,各例標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實。胃癌患者40例,男25例,女15例;年齡 36～78(58.7± 11.5)歲;早期胃癌8例,進(jìn)展期胃癌 29例,晚期胃癌 3例;術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療。對照組選取同期鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診胃鏡室經(jīng)病理證實為正常胃組織標(biāo)本 20例,患者中男 13例,女 7例;年齡37～80(58.9±11.7)歲。

1.2 主要試劑 Trizol試劑(美國Invitrogen生物科技公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物科技公司);內(nèi)參β-actin、STAT3和SOCS3mRNA引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成。

1.3 2種組織中STAT3與SOCS3 m RNA的測定方法 取100 mg胃癌組織及正常胃組織用精細(xì)剪刀剪碎后,放入研缽中研碎,用加樣槍加入Trizol試劑1 mL研磨勻漿,按照標(biāo)準(zhǔn)的RNA提取步驟提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明分別合成胃癌和正常胃組織的cDNA,提取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴增。引物序列:β-actin,上游5'-CTGGGACGACATG GAGAAAA-3',下游5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGT GC-3',擴增產(chǎn)物大小564 bp;STAT3,上游5'-AA CATGCCCATTCGCTTTAC-3',下游5'-TCTCCTTC CCCATACACCTG-3',擴增產(chǎn)物大小317 bp;SOCS3,上游5'-GGACCCAGCATAGGAAAGC-3',下游5'-AAAACCACCCCAACACACAA-3',擴增產(chǎn)物大小482 bp。PCR反應(yīng)體系(50μL)含cDNA 2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,10×BufferⅡ5μL, dNTPs 4μL,DNA聚合酶1μL,ddH2O 36μL。PCR反應(yīng)條件:94℃5min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1m in,共35個循環(huán);72℃10m in。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL經(jīng)含1μL EB的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,首先90 V 10min,然后70 V 20m in。于凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海微圖儀器科技發(fā)展有限公司)下觀察并攝像,以目的基因條帶的灰度與β-actin條帶灰度的比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析,采用兩獨立樣本t檢驗比較2種組織中STAT3和SOCS3 mRNA相對表達(dá)量有無差異,采用Spearman秩相關(guān)分析2種組織中SOCS3和STAT3 mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2種組織中STAT3和SOCS3m RNA的表達(dá)見圖1和表1。

2.2 2種組織中STAT3和SOCS3 mRNA相對表達(dá)量的相關(guān)性分析 STAT3和SOCS3在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.965,P＜0.001),在正常組織中的表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.093,P=0.698)。

圖1 STAT 3與SOCS3RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

表1 2種組織中STAT 3和SOCS3m RNA相對表達(dá)量的比較

3 討論

JAK/STAT信號通路在增殖、分化和凋亡等各種細(xì)胞重要功能的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞因子/生長因子與 JAK的細(xì)胞膜受體結(jié)合后,存在于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子STAT3的酪氨酸殘基受到磷酸化而激活,形成二聚體的p-STAT3進(jìn)入到細(xì)胞核后與DNA結(jié)合從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[2]。STAT的高表達(dá)往往出現(xiàn)在惡性增殖性疾病中,此時SOCS系統(tǒng)極有可能處于低反應(yīng)狀態(tài)[3-4]。趙淑華等[5]研究證實:STAT3-siRNA可抑制腫瘤組織中STAT3、VEGF和Survivin蛋白表達(dá),從而抑制腫瘤生長。馬洪濤等[6]研究證實:p-STAT3的表達(dá)水平與卵巢上皮性癌的發(fā)生及惡性生物學(xué)行為密切相關(guān),惡性程度越高,臨床分期越晚,則p-STAT3的表達(dá)水平越高。吳民華等[7]發(fā)現(xiàn)癌組織中 STAT3和p-STAT3表達(dá)水平均明顯高于慢性鼻咽炎組織。SOCS3是SOCS家族中最活躍的成員之一,也是Janus激酶和信號轉(zhuǎn)錄因子及活化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的抑制因子,SOCS3可被IL-6、紅細(xì)胞生成素、瘦素和粒細(xì)胞集落刺激因子等多種細(xì)胞刺激因子強烈誘導(dǎo)表達(dá)[8],負(fù)性調(diào)節(jié)該通路及其下游原癌基因STAT3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),阻止細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及凋亡抑制。Lu等[8]研究證實:在腫瘤細(xì)胞系中SOCS3的表達(dá)受到抑制后可導(dǎo)致STAT3的強烈激活。目前已經(jīng)證實STAT3所調(diào)控的目的基因和蛋白參與細(xì)胞的生存和增殖[9-11]。國外研究[12]顯示 STAT3在許多腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活,對STAT3的抑制可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

該研究結(jié)果顯示:STAT3在正常胃組織中的表達(dá)低于胃癌組織,SOCS3在正常胃組織中的表達(dá)高于胃癌組織,提示STAT3與胃癌的關(guān)系密切,參與了胃癌的發(fā)生。該研究發(fā)現(xiàn)STAT3與SOCS3在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),正常組織無相關(guān),提示SOCS3在胃癌中作為一個抑癌基因?qū)TAT3起抑制作用。SOCS3有可能成為胃癌分子靶向治療的靶點,為胃癌的診斷與治療提供理論支持。研究[13-15]發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤組織中,通過超甲基化使SOCS3沉默可以導(dǎo)致腫瘤的增殖和生長,這為研究STAT3和SOCS3在胃癌中的具體作用機制及其與胃癌的生物學(xué)關(guān)系提供了新的思路和線索。

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