邵麗春,郭曉鐘,徐建華,鄧國(guó)偉

1)解放軍第 463醫(yī)院消化內(nèi)科沈陽(yáng) 110042 2)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科沈陽(yáng) 110016 3)沈陽(yáng)軍區(qū)空軍門(mén)診部?jī)?nèi)科沈陽(yáng)110015

△女,1970年2月生,碩士,副主任醫(yī)師,研究方向:消化系統(tǒng)疾病

胰腺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤,以轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差為特征,5 a生存率低。DPC4為新的腫瘤抑制基因,在 50%胰腺癌中存在失活[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)DPC4基因參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。Bcl-2和Bax是Bcl家族的成員,在凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)細(xì)胞生存周期,增加細(xì)胞對(duì)多種凋亡刺激的抗性,但并不刺激細(xì)胞增生。Bax是凋亡促進(jìn)基因,能夠拮抗 Bcl-2抑制凋亡。作者通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pBK-CMV-DPC4質(zhì)粒導(dǎo)入人胰腺癌細(xì)胞系JF305中,觀察轉(zhuǎn)染DPC4基因后JF305細(xì)胞的凋亡情況以及生長(zhǎng)、增殖等生物學(xué)行為的改變,初步探討DPC4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡與抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 ①細(xì)胞:JF305細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)。②質(zhì)粒:重組質(zhì)粒pBK-CMV-DPC4和空白質(zhì)粒pBK-CMV均由德國(guó)Hahn教授惠贈(zèng);質(zhì)粒經(jīng)大連寶生物公司測(cè)序后證實(shí)含DPC4 cDNA的完整全長(zhǎng)序列,無(wú)突變及插入等改變。③主要試劑及儀器:二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。鼠抗人DPC4單克隆抗體購(gòu)自上海生工生物工程有限公司,熒光標(biāo)記二抗、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及鼠抗人Bax單克隆抗體及試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。BCA Protein Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。Facsort流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。3550型酶聯(lián)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。Lipofectamine2000購(gòu)自LIFE Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 JF305貼壁細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pBK-CMV-DPC4和空質(zhì)粒pBK-CMV分別轉(zhuǎn)染JF305細(xì)胞,轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)400mg/L的G418培養(yǎng)5～6周,篩選出抗 G418的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。收集未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pBK-CMV-DPC4和轉(zhuǎn)染pBK-CMV的細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá) 分別收集 3種細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù) 5%胎牛血清的PBS液清洗并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107mL-1。取0.1mL置于流式管中標(biāo)記,另取一管作空白對(duì)照。加入鼠抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體(1∶50稀釋)混勻,4℃過(guò)夜。加入熒光標(biāo)記的二抗 3μL,避光,室溫孵育30min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 Western blot法檢測(cè)DPC4蛋白的表達(dá) 分別收集 3種細(xì)胞,用 PBS清洗 2次,加入細(xì)胞裂解液,混勻,用刮匙刮取,移入1.5m L EP管中,置于冰上15 min,于低溫離心機(jī)中13 000 r/min離心10 min,取上清,-20℃凍存。用BCA Protein Assay試劑盒測(cè)定樣本上清液中蛋白濃度,然后進(jìn)行垂直平板電泳。分離膠80 g/L,濃縮膠40 g/L。電泳后,將凝膠、濾紙及硝酸纖維素膜浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30min,之后利用Mini-ProteinⅡ型電轉(zhuǎn)槽進(jìn)行轉(zhuǎn)印,100 V恒壓轉(zhuǎn)印80min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后,取下硝酸纖維素膜用含40 g/L脫脂奶粉的Tween20-PBS溶液室溫封閉1.5 h。滴加1∶200鼠抗人DPC4單克隆抗體,室溫下振蕩孵育1 h。顯影拍照。用Graph-Pad PRISM軟件掃描分析圖像,計(jì)量陽(yáng)性條帶的灰度值。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3種細(xì)胞,常規(guī)消化配置成單細(xì)胞懸液。以1× 103/孔接種于 96孔板中,每種細(xì)胞設(shè) 24孔,以培養(yǎng)液為空白對(duì)照,重復(fù) 5塊板。常規(guī)CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后取出其中一塊板,每孔加入5 g/L的MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加入150μL DMSO,振蕩10 min使MTT充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm的吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖率,增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。以后每24 h取一塊板按上述步驟進(jìn)行測(cè)定,每組測(cè)定5次。

1.3.4 細(xì)胞周期測(cè)定 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。將 3種細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液 1×106mL-1,上機(jī)測(cè)定細(xì)胞周期。重復(fù) 3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。3組細(xì)胞DPC4、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平, Bcl-2/Bax比值,細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周期的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種細(xì)胞DPC4、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 3種細(xì)胞DPC 4、Bcl-2及Bax蛋白測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2 3種細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表2、3。

表2 3種細(xì)胞增殖率檢測(cè)結(jié)果(n=5)

表3 3種細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果(n=3) %

3 討論

以往的研究[5]表明 DPC4對(duì)胰腺癌細(xì)胞株、乳癌細(xì)胞株有明顯的促凋亡作用。Dai等[5]將野生型DPC4基因?qū)肴巳榘┘?xì)胞后,細(xì)胞出現(xiàn) G1期停滯和凋亡,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Smad4核移位直接誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo)凋亡作用不依賴(lài) P53和 RB蛋白[5]。袁晟光等[2]將 DPC4基因?qū)胍认侔┘?xì)胞株HS766中,細(xì)胞亦發(fā)生凋亡,同時(shí)發(fā)現(xiàn) DPC4基因只有在TGF-B信號(hào)傳遞系統(tǒng)的其他成員共同作用下才能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ke等[6]證實(shí)DPC4基因參與了小細(xì)胞肺癌的發(fā)生,并通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡基因Bcl-/ Bax之間的平衡誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

作者將DPC4基因成功轉(zhuǎn)染入JF305細(xì)胞,觀察DPC4、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá),并觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖力的變化。結(jié)果顯示,胰腺癌JF305細(xì)胞株轉(zhuǎn)染DPC4基因后,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞周期停滯在G1期,轉(zhuǎn)染后JF305細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)明顯下降,Bax蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng),Bcl-2/Bax比值下降,表明轉(zhuǎn)染DPC4的JF305細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)。由此推測(cè)DPC4通過(guò)調(diào)整抑制凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng),但具體機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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