張俊杰,宋麗君,劉建新,陳 輝,李曉文#

1)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室鄭州 450001 2)深圳建安醫(yī)藥有限公司深圳 518027 #通訊作者,女,1955年8月生,教授,研究方向:遺傳病的分子機制與基因診斷,E-mail:lixiaowen@zzu.edu.cn

Y染色體短串聯(lián)重復序列(Y-short tandem repeat,Y-STR)呈精確的父系單倍體連鎖遺傳,具有多態(tài)性信息含量高、擴增片段小、檢測靈敏度高、分型簡便及宜于推廣應(yīng)用等特點,在進行父系親權(quán)鑒定等特殊案例中具有常染色體 STR無法比擬的優(yōu)點。目前 Y-STR的研究[1-4]熱點集中于單倍型多樣性,尋求新的高多態(tài)性Y-STR基因位點構(gòu)建單倍型是提高單倍型多樣性的關(guān)鍵。此外,由于Y-STR基因位點具有明顯的民族和地域差異,因此任何新位點在構(gòu)建單倍型進行實際應(yīng)用前都應(yīng)首先研究其在該群體或種族中的基因多樣性[5]。作者調(diào)查了DYS713和DYS720基因位點在河南漢族群體中的遺傳學數(shù)據(jù),以期為單倍型的構(gòu)建提供高多態(tài)性的Y-STR基因位點,為法醫(yī)物證學鑒定提供參考數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇 203名河南漢族無親緣關(guān)系體檢健康的男性個體,抽取外周靜脈血液2mL,EDTA抗凝。所有研究對象對該研究均知情同意。

1.2 DYS713和DYS720基因位點的PCR鑒別常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取外周血基因組 DNA。2個Y-STR基因位點的引物序列均來源于STRBase (http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。DYS713上游引物序列5'-GTGCAAGCCAAGGGCTTTATAAGT-3',下游引物序列5'-CCTGGGTGACAGACTC CATCTTAAA-3';DYS720上游引物序列 5'-AGAGAGAGAGGGAGAGAGAACG-3',下游引物序列5'-TCTGGTGTG TGAAGGACAGC-3'。PCR反應(yīng)體系:Mix 10μL,DNA 1.7μL,引物終濃度1μmol/ L,ddH2O補充至 20μL。擴增條件:96℃預變性2 min;94℃變性1 min,60℃退火1 min,70℃延伸1.5min,10個循環(huán);90℃1min,60℃1 min,70℃1.5min,20個循環(huán);60℃延伸30min后4℃保存。取10μL擴增產(chǎn)物,在80 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,銀染顯帶。

1.3 等位基因分型標準品的制備及結(jié)果判定[6-7]

自制等位基因分型標準品并經(jīng) DNA測序確定其堿基序列,按國際法醫(yī)遺傳學學會DNA委員會(ISFG DAN Commission)推薦的命名原則進行命名。根據(jù)分型標準品梯階對照命名待檢等位基因。等位基因頻率(P)采用直接計數(shù)法:Pi=n/N;基因多樣性(gene diversity,GD)=n(1-∑Pi2)/(n-1);個體識別力(discriminating power,DP)=1-∑Pi2;其中, n為等位基因個數(shù),N為樣本數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0進行分析,應(yīng)用χ2檢驗比較河南、河北男性人群中 2個基因位點的差異,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DYS713和DYS720基因位點檢測結(jié)果 見表1。DYS713基因位點擴增條帶312～340 bp,共檢出 8個等位基因,根據(jù)其核心重復單位的拷貝次數(shù)的不同分別命名為等位基因 28～35(圖 1); DYS720基因位點擴增條帶219～255 bp,共檢出 10個等位基因,分別命名為等位基因 27～36(圖 2)。

表1 DYS713和DYS720基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果(n=203)

2.2 河南、河北[5]人群DYS713和DYS720位點的比對分析 見表2。

表2 河南、河北人群DYS713、DYS720位點的比較

3 討論

Y-STR由2～6個核苷酸組成的核心單元不斷重復排列構(gòu)成,多態(tài)性信息含量高。目前常染色體STR在法醫(yī)學和遺傳學等親權(quán)鑒定中廣泛應(yīng)用,但在父系男性成員間進行親權(quán)鑒定及主要為女性成分的混合斑鑒定等特殊案例中,Y-STR是常染色體STR檢測的重要輔助參考。另外,Y-STR基因位點無雜合態(tài),可以用于男性混合樣本或男女混合樣本遺傳標記的區(qū)分[3,8-9]。20世紀初期,各實驗室大多采用MHL進行單基因座擴增實驗研究,為進一步提高Y-STR在實際工作中的鑒別能力,各實驗室對其進行擴展,加入其他新的高多態(tài)性Y-STR基因位點,并構(gòu)建不同的復合擴增體系進行單倍型多態(tài)性研究。雖然增加Y-STR基因位點的檢測數(shù)目可提高其單倍型多態(tài)性,但在實際應(yīng)用中,并非檢測的基因位點數(shù)目越多,單倍型多樣性和個體識別能力就越高,單倍型多樣性的高低與構(gòu)成單倍型的各個基因位點的基因多態(tài)性密切相關(guān)。因此,選擇多態(tài)性高的基因位點構(gòu)建單倍型,是增加單倍型多樣性和提高其應(yīng)用價值的關(guān)鍵[10-15]。

作者的實驗結(jié)果顯示,DYS713和DYS720基因位點的基因多樣性分別為 0.729 8和 0.777 8,且這2個基因位點的擴增片段小(200～350 bp),等位基因數(shù)目相對較多,分別為 8和 10個,擴增條帶清晰且易于區(qū)分,檢出靈敏度高,具有高度的種屬特異性和較低的突變率。因此,DYS713和DYS720基因位點在河南地區(qū)個體識別和親權(quán)鑒定等檢測實驗當中均具有較高的應(yīng)用價值。由目前可查閱的文獻可知,這 2個基因位點在國內(nèi)外的研究應(yīng)用極少,可用來對比參考的數(shù)據(jù)也很少,因此,這 2個基因位點的民族及地域性差異還有待進一步深入研究。

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