管一春,楊雪峰,王興玲,孫麗君,王雪梅,婁 華,李巍巍

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心鄭州 450052 2)鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州 450052△女,1977年5月生,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:生殖內(nèi)分泌,E-mail:lisamayguan@126.com

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育齡婦女常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病,是無排卵性不孕的主要原因。臨床中發(fā)現(xiàn),經(jīng)促排卵治療, PCOS患者的排卵缺陷糾正后,妊娠率仍低,流產(chǎn)率則很高。研究[1]認為PCOS患者機體內(nèi)分泌和代謝的異常可導致子宮內(nèi)膜容受性下降,子宮內(nèi)膜發(fā)育和內(nèi)膜對胚泡容受性失調(diào)可成為生育能力低下和不良生殖結(jié)局的原因之一。同源框基因(homeobox gene,HOX)A10作為一種多效性轉(zhuǎn)錄因子參與胚胎種植的各個環(huán)節(jié),如子宮內(nèi)膜的增殖與分化、子宮內(nèi)膜容受性的建立和胚胎的定位與黏附等環(huán)節(jié),它是胚胎著床和成功妊娠所必需的[2]。作者采用免疫組化SP法檢測PCOS患者不同組織分期子宮內(nèi)膜HOXA10蛋白的表達情況,探索PCOS子宮容受性異常的原因,為臨床研究提供新思路和依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集 2008年 10月至 2009年 10月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心就診的已婚PCOS患者20例,年齡23～33(28.5±3.3)歲。PCOS診斷依據(jù) 2003年鹿特丹標準[3]。同期就診的已婚不孕癥(不孕原因為男方因素或輸卵管梗阻,擬行體外受精-胚胎移植治療)患者26例作對照,年齡25～40(28.7±4.1)歲。月經(jīng)周期性激素水平和盆腔超聲檢查均正常。研究對象對該研究均知情同意,且排除其他內(nèi)分泌疾病,3個月內(nèi)無激素類藥物應用史,無心、肝和腎疾病史。

1.2 標本采集 所有患者均于月經(jīng)周期的5～14 d和自然周期或使用氯米芬/人絕經(jīng)期促性腺激素/人絨毛膜促性腺激素方案促排卵周期的著床窗口期(陰道超聲監(jiān)測確認排卵后 7～8 d,血總絨毛膜促性腺激素T-HCG證實未孕)無菌操作下使用Pipelle管吸刮子宮前后壁,采集子宮內(nèi)膜組織標本。根據(jù)Noyes標準判定組織學分期:PCOS增生期13例,分泌中期 7例;對照增生期 16例,分泌中期 10例。

1.3 子宮內(nèi)膜病理組織學檢查 將子宮內(nèi)膜組織標本迅速置于體積分數(shù) 10%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水,梯度乙醇脫水后石蠟包埋,行HE染色。鏡下觀察其間質(zhì)反應不良和內(nèi)膜分泌反應欠佳發(fā)生情況。

1.4 子宮內(nèi)膜組織HOXA10蛋白的表達 采用免疫組織化學SP法。組織切片脫蠟,抗原熱修復后加入一抗HOXA10(羊抗人多克隆抗體,工作濃度為1∶50,美國Santa Cruz公司),4℃過夜,滴加生物素標記的二抗(羊抗鼠,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),DAB顯色,蘇木素復染,封片。試劑公司提供的已知陽性片作為陽性對照,PBS代替一抗作為陰性對照。以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為染色陽性細胞。每張切片隨機選取不重疊的 5個高倍鏡視野(×400),使用Powersite顯微圖像采集分析系統(tǒng)分別測量 HOXA10陽性區(qū)的灰度值,結(jié)果取平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0分析。各組子宮內(nèi)膜組織中HOXA10蛋白表達的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗;PCOS和對照增生期組間質(zhì)反應不良發(fā)生率以及PCOS和對照分泌中期組內(nèi)膜分泌反應欠佳發(fā)生率比較采用確切概率法,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組患者子宮內(nèi)膜病理組織學觀察 見圖1。PCOS患者間質(zhì)反應不良發(fā)生率為50.0%(10/20),高于對照患者的15.4%(4/26)(P=0.022)。PCOS分泌中期組子宮內(nèi)膜分泌反應欠佳發(fā)生率為85.7% (6/7),高于對照分泌中期組的10.0%(1/10)(P= 0.004)。

2.2 各組患者子宮內(nèi)膜組織中HOXA 10的表達HOXA10主要表達于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。見圖2和表1。

表1 各組子宮內(nèi)膜組織HOXA 10蛋白的表達

3 討論

PCOS患者體內(nèi)異常的內(nèi)分泌環(huán)境對子宮內(nèi)膜形態(tài)和功能有一定的不良影響[4]。PCOS患者自然月經(jīng)周期絕大部分均為無排卵周期,作者采用促排卵方案來獲取其分泌中期的子宮內(nèi)膜。研究結(jié)果顯示,50%的PCOS患者子宮內(nèi)膜表現(xiàn)間質(zhì)反應不良,間質(zhì)呈現(xiàn)局灶性致密,提示PCOS患者的子宮內(nèi)膜對性激素的反應性下降,缺乏隨激素水平變化的能力,影響蛻膜化,進而影響著床。其分泌中期的子宮內(nèi)膜中,分泌反應欠佳發(fā)生率高達 85.7%,則提示PCOS患者應用促排卵治療后,可正常排卵,但黃體功能較差,與報道[5]一致。

同源框基因?qū)儆诙嗷蚣易宓霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因,通過和DNA結(jié)合激活或抑制目標基因的表達。研究[6]發(fā)現(xiàn),野生的小鼠胚胎不能在HOXA 10基因缺失的小鼠子宮內(nèi)著床。當轉(zhuǎn)染持續(xù)表達 HOXA 10的質(zhì)粒時,可提高移植胚胎的著床率[7]。小鼠胚胎著床前轉(zhuǎn)染HOXA 10抑制劑可降低其在子宮內(nèi)膜的表達,并觀察到胞飲突數(shù)量顯著減少;而胞飲突形成前強化HOXA10的表達則其數(shù)量增加,HOXA 10基因可調(diào)控胞飲突的發(fā)育[8]。以上研究均提示, HOXA10基因的持續(xù)表達是胚胎著床所必需的。

李紅等[9]認為 HOXA10在增生期子宮內(nèi)膜低表達,分泌中期至晚期子宮內(nèi)膜則高表達,且間質(zhì)表達明顯高于腺體。作者發(fā)現(xiàn),HOXA10在正常增生期和分泌中期子宮內(nèi)膜均表達,定位于間質(zhì)細胞的胞核,未見腺上皮細胞的表達。研究[10]表明,不明原因不孕、輸卵管積水等各種類型不孕患者,其分泌中期子宮內(nèi)膜HOXA10表達較正常對照組顯著下降。該研究結(jié)果顯示,HOXA10在PCOS患者增生期和分泌中期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的胞核中均表達,呈現(xiàn)周期性變化,而在分期相同的子宮內(nèi)膜,PCOS患者HOXA10的表達水平顯著低于其對照組。

HOXA10可通過誘導其下游基因的激活或抑制而發(fā)揮作用。而研究[11]發(fā)現(xiàn),PCOS患者內(nèi)膜整合素 β3表達也下降。整合素 β3是目前公認的內(nèi)膜容受性標志物之一[12],而 HOXA 10作為其上游基因,在植入的各過程中發(fā)揮作用,影響內(nèi)膜容受性。該研究結(jié)果顯示,PCOS患者增生期和促排卵治療后分泌中期的子宮內(nèi)膜,其HOXA10的表達低于正常對照。提示PCOS患者固有的低雌激素狀態(tài)、促排卵治療后的黃體期孕酮分泌減少,均可影響其內(nèi)膜HOXA10的表達,進而影響其內(nèi)膜容受性。PCOS患者過高的雄激素也可對抗雌激素和孕酮與相應受體的結(jié)合影響內(nèi)膜HOXA 10的表達,此外雄激素可增加雄激素受體(androgen receptor,AR)的表達[13],過多的AR可直接作用內(nèi)膜,使PCOS患者HOXA10表達下降,從而影響了其下游的內(nèi)膜容受性相關的分子途徑,導致PCOS患者妊娠率低和流產(chǎn)率高。

總之,HOXA10在PCOS患者子宮內(nèi)膜的低表達可能參與了其內(nèi)膜容受性下降的發(fā)生、發(fā)展過程。因此,未來可通過定向子宮內(nèi)膜基因治療,如在著床期調(diào)控性激素濃度,上調(diào)PCOS患者內(nèi)膜HOXA10的表達,改善其內(nèi)膜容受性,提高PCOS的胚胎著床率和妊娠率,降低流產(chǎn)率。

[1]Guzick DS.Polycystic ovary syndrome[J].Obstet Gynecol,2004,103(1):181

[2]Navaratnarajah R,Pillay OC,Hardiman P.Polycystic ovary syndrome and endometrial cancer[J].Semin Reprod Med,2008,26(1):62

[3]Nikas G,Aghajanova L.Endometrial pinopodes:some more understanding on human imp lantation[J].Reprod Biomed Online,2002,4(Supp 1 3):18

[4]Acosta AA,Elberger L,Borghi M,et al.Endometrial dating and determination of the window of implantation in healthy fertile women[J].Fertil Steril,2000,73(4):788

[5]Lindhard A,Bentin-Ley U,Ravn V,etal.Biochem ical evaluation of endometrial function at the time of implantation [J].Fertil Steril,2002,78(2):221

[6]Nakamura H,Kimura T,Ogita K,et al.Alteration of the timing of implantation by in vivo gene transfer:delay of implantation by suppression ofnuclear factor kappaB activity and partial rescue by leukemia inhibitory factor[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,321(4):886

[7]Bagot CN,Troy PJ,Taylor HS.Alteration of maternal Hoxa10 expression by in vivo gene transfection affects imp lantation[J].Gene Ther,2000,7(16):1378

[8]Taylor H,Arici A,Olive D,et al.HOXA-10 is expressed in response to sex steroids at the time of implantation in the human endometrium[J].JClin Invest,1998,101(7):1379

[9]李紅,陳士嶺,邢福祺.HOXA10基因在子宮內(nèi)膜組織中的表達及與不孕的關系[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002, 37(1):30

[10]陳輝,孫曙光,曲陸榮,等.不明原因不孕婦女分泌期子宮內(nèi)膜Hoxa-10mRNA表達意義的研究[J].中國醫(yī)科大學學報,2003,32(3):252

[11]Apparao KB,Lovely LP,Gui Y,etal.Elevated endometrial androgen receptor exp ression in women with polycystic ovarian synd rome[J].Biol Reprod,2002,66(2):297

[12]Cermik D,Selam B,Taylor HS,et al.Regulation of HOXA-l0expression by testosterone in vitro and in the endometrium of patients with polycystic ovary syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(1):238

[13]Mertens HJ,Heineman MJ,Theunissen PH,et al.Androgen,estrogen and progesterone recep tor exp ression in the human uterus during themenstrual cycle[J].Eur JObstect Gynecol Rep rod Biol,2001,98(1):58