方 莉,白金娟,連亞軍#,徐會(huì)茹,顧 盼

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者,女,1964年4月生,博士,主任醫(yī)師,研究方向:頭疼和癲癇,E-mail:lianyajun369@sina.com

近年來疼痛中樞敏感化在偏頭痛發(fā)病機(jī)制的研究中被越來越多提及[1],研究[2]表明中樞敏感化的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在密切聯(lián)系。絲裂原活化蛋白激酶家族c-Jun氨基末端激酶-1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK-1)可對(duì)多種細(xì)胞外刺激發(fā)生反應(yīng)而調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào),JNK-1在短暫缺血后線粒體依賴的凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。G-蛋白耦聯(lián)受體家族蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptor-2, PAR-2)活化后引起信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與炎癥、疼痛與修復(fù)等許多病理生理過程,其在神經(jīng)系統(tǒng)也有較高表達(dá)[3-4]。據(jù)報(bào)道[5]由當(dāng)歸、天麻等組成的中藥頭痛寧對(duì)偏頭痛的防治效果良好,具有綠色鎮(zhèn)痛和無藥物依賴性的優(yōu)點(diǎn),藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和解痙作用,但其分子水平作用機(jī)制尚不明確。該研究采用硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型,觀察頭痛寧干預(yù)前后大鼠硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)及腦干區(qū)JNK-1和PAR-2的表達(dá),探究偏頭痛發(fā)病機(jī)制及頭痛寧的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及藥品 SD大鼠 30只,雌雄各半,體質(zhì)量 250～300 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔抗大鼠JNK-1和PAR-2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品),山羊抗兔二抗、SP-9001免疫組化染色試劑盒和DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),頭痛寧(咸陽步長制藥有限公司),硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分為正常對(duì)照組、模型組和頭痛寧治療組,每組10只。正常對(duì)照組大鼠皮下(前額、雙顳部)注射生理鹽水1.04 m L/kg。模型組和治療組大鼠皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg,建立實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型,以動(dòng)物出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭和爬籠次數(shù)增多等頭部不適癥狀為造模成功。模型組造模 30 min后灌胃蒸餾水1.04 mL/kg,治療組造模15～20 min后灌胃頭痛寧1.2 g/kg,1次/d,共1周。

1.3 腦組織中JNK-1和PAR-2表達(dá)的免疫組化檢測 1周后,用體積分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛(3.5 m L/kg)腹腔注射麻醉,灌注后在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)和腦干區(qū) 3個(gè)部位取材,連續(xù)冠狀面切片,每片厚約4μm。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色,JNK-1和PAR-2一抗工作濃度均為1∶200,以PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。切片背景為淡黃或無色,陽性細(xì)胞呈黃棕色,多為圓形或卵圓形,可聚集成線狀、顆粒樣、條塊狀或零星散在。采用病理圖像分析系統(tǒng),所有切片在同一強(qiáng)度、同一放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察, JNK-1及PAR-2陽性反應(yīng)的標(biāo)記強(qiáng)度用平均積分光密度表示。每張切片選取 5個(gè)視野,取其平均值進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析,對(duì)3組JNK-1及PAR-2蛋白積分光密度值行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且方差齊,再用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較3組大鼠大腦不同部位JNK-1和PAR-2積分光密度值,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)變化 模型組和治療組給予硝酸甘油5～10min后開始出現(xiàn)前肢頻繁撓頭動(dòng)作及爬籠現(xiàn)象,30～60 m in后 2組撓頭次數(shù)及爬籠次數(shù)增多。模型組上述表現(xiàn)在 120 min后開始減少, 180min時(shí)全部消失。治療組上述現(xiàn)象于 60～120 min后逐漸減少至全部消失。

2.2 各組大鼠大腦不同部位JNK-1和PAR-2的表達(dá) 模型組大鼠硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)和腦干區(qū)均可見JNK-1和PAR-2陽性神經(jīng)元,但以硬腦膜區(qū)棕黃色陽性反應(yīng)顆粒最大最密集,其次為三叉神經(jīng)節(jié)區(qū)、腦干區(qū)(圖 1和表 1)。對(duì)照組和治療組大鼠上述各部位JNK-1和PAR-2的分布特征與模型組相同,但均低于模型組,對(duì)照組和治療組各部位JNK-1和PAR-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)和腦干區(qū)JNK-1及PAR-2的表達(dá)上:硬腦膜組織;中:三叉神經(jīng)節(jié)組織:下:腦干區(qū)。A:對(duì)照組;B:模型組;C:治療組。1:JNK-1;2:PAR-2。

表1 各組大鼠大腦不同部位JNK-1和PAR-2積分光密度比較

3 討論

研究[4]發(fā)現(xiàn) PAR-2廣泛表達(dá)于腦組織及外周神經(jīng)系統(tǒng),其活化與神經(jīng)源性炎癥、疼痛和痛覺過敏有關(guān),但具體作用機(jī)制不明。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶(PAK),在胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[6]。在哺乳動(dòng)物中MAPK家族主要有3種:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERKs),JNK/SAPK和p38 MAPK。研究[7]表明MAPK在疼痛中樞敏感化的形成和發(fā)展中可能起重要作用。外界刺激可通過Ras依賴或非Ras依賴兩條途徑激活JNK,小分子G蛋白R(shí)as超家族的成員之一Rho可能也是JNK激活的上游信號(hào)[8],Rho蛋白R(shí)ac及cdc42的作用可能是與p21激活的PAK結(jié)合,使其自身磷酸化而被激活,而活化的 PAK進(jìn)一步使JNK激活[9],經(jīng)一系列反應(yīng)使核內(nèi)c-Jun磷酸化,進(jìn)而激活c-Jun而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[10],促進(jìn)c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體的形成,也可結(jié)合于基因啟動(dòng)子位點(diǎn),增加特定基因的轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄因子活性等,引起大量與凋亡有關(guān)的基因表達(dá),與細(xì)胞延遲性死亡關(guān)系密切[11]。JNK信號(hào)途徑也參與許多病理過程[12]。當(dāng)三叉神經(jīng)受到外界理化因素刺激時(shí)JNK表達(dá)增多,并引起一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng),最終引起組蛋白乙?；?這均可使三叉神經(jīng)對(duì)周圍刺激的敏感性提高[13]。

以上兩類受體活化都可將胞外的信息傳遞到胞內(nèi),并通過調(diào)節(jié)基因表達(dá),使中樞可塑,由此一些學(xué)者認(rèn)為其活化表達(dá)可能參與偏頭痛發(fā)作,但相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究卻并不多見。

作者的研究結(jié)果顯示,模型組JNK-1及PAR-2在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)及腦干區(qū)的表達(dá)均上調(diào),用頭痛寧治療后二者的表達(dá)下調(diào),提示JNK-1和PAR-2參與了偏頭痛的發(fā)生;中藥頭痛寧作用可能的機(jī)制是通過拮抗G蛋白偶聯(lián)受體來抑制信號(hào)傳導(dǎo),從而起到防治偏頭痛的作用。

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