郭慧麗,張明昌,鄭乃剛,吳景蘭,王愛鳳

1)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科武漢 430032 2)鄭州大學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)研究中心 鄭州 450001 3)河南省人民醫(yī)院眼科鄭州 450003

△女,1965年5月生,碩士,主任醫(yī)師,研究方向:眼底病的基礎(chǔ)與臨床,E-mail:gse_2005@126.com

槲皮素為無毒性植物類黃酮的有效成分之一,可通過阻抑蛋白激酶C(PKC)信號途徑發(fā)揮抗癌效應(yīng)[1]。無毒性的8-Br-cAMP為cAMP類似物,通過與PKA受體Ⅱ型(PKARⅡ)結(jié)合,抑制癌細(xì)胞的增殖而促進(jìn)其分化[2]。作者觀察了納米脂質(zhì)體槲皮素(nLQ)和8-Br-cAMP(Br)誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Rb44細(xì)胞凋亡的協(xié)同效應(yīng),并應(yīng)用原位雜交檢測抑癌基因p53和p21waf1 mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)和最終共同凋亡途徑Caspase-3蛋白的表達(dá),初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Rb44細(xì)胞購自湖南長沙湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。槲皮素、80 nm孔徑濾膜、Br、Triton-X100及細(xì)胞裂解液購自美國Sigma公司;胎牛血清購自天津TBD公司;蛋白酶K、NBT/BCIP、鯡魚精DNA、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-AP)以及探針標(biāo)記盒購自美國Promega公司;biotin-16-dUTP購自德國Rouche公司;免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)中一抗購自美國Santa Cruz及Zymed公司;通用型SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 nLQ的制備 將槲皮素、膽固醇、卵磷脂、腦磷脂及聚乙二醇-4 000以質(zhì)量比 6∶4∶9∶5∶1混勻,用V氯仿:VDMSO為 3∶1的溶劑完全溶解,真空旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4～8 h,PBS水化,將脂質(zhì)體槲皮素置于超聲破碎儀中反復(fù)多次破碎,制備的脂質(zhì)體槲皮素通過80 nm濾膜后獲得nLQ。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將Rb44細(xì)胞置于加有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640液中,在36.5℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱(Sanyo,日本)內(nèi)培養(yǎng)。Rb44細(xì)胞分為4組:nLQ組給予終濃度為40μmol/ L nLQ;Br組給予終濃度為2×10-5mol/L 8-BrcAMP,聯(lián)合用藥組給予同上濃度的nLQ和Br,對照組不給藥。

1.4 各組細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL法。40 g/L多聚甲醛固定各組細(xì)胞標(biāo)本,以冷風(fēng)吹透,體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton-X100/PBS透化后,5 g/L蛋白酶K 37℃消化標(biāo)本10min,40 g/L多聚甲醛后固定5 min。各標(biāo)本加15μL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)緩沖液,4℃過夜。pH7.5的Tris-Cl緩沖液1∶500稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的SA-AP,37℃孵育20 min,NBT/ BCIP 37℃孵育30 min,顯色。同時(shí)設(shè)以PBS代替TdT酶孵育液的陰性對照。選取細(xì)胞數(shù)目較多的視野,連續(xù)計(jì)數(shù) 200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞p53和P21 waf1m RNA的檢測40 g/L多聚甲醛固定的各組細(xì)胞標(biāo)本以冷風(fēng)吹透,體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton-X100/PBS透化后,經(jīng)5 g/L蛋白酶K 37℃消化10min,40 g/L多聚甲醛后固定5 min,2×SSC洗滌。經(jīng)2.3 g/L三乙醇胺和0.1 mol/L醋酸酐處理10 min后,加不含探針而含鯡魚精DNA的雜交液預(yù)雜交,42℃3 h,生物素標(biāo)記的p53 cDNA探針或p21waf1 cDNA探針工作濃度為1∶100,42℃下雜交過夜。雜交后以0.1×SSC洗4次,每次15min。10 g/L乙?；疊SA封閉37℃10 min,加1∶1 000稀釋的SA-AP 37℃孵育20 min,再先后以Tris-Cl、pH 7.5和pH 9.5的緩沖液洗標(biāo)本,用NBT/BCIP底物顯示藍(lán)紫色雜交信號,同時(shí)設(shè)不加探針的陰性對照。應(yīng)用圖像掃描儀(中國山富)掃描圖像獲灰度均值。

1.6 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的檢測40 g/L多聚甲醛固定各組細(xì)胞標(biāo)本,以體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton-X100/PBS和正常血清封閉處理后,應(yīng)用Bcl-2、Bax及Caspase-3的一抗,其中Caspase-3為兔的多抗以外,其他均為鼠的單抗。各抗的工作濃度均為1∶100。加通用型SP試劑孵育,DAB顯色。同時(shí)設(shè)以PBS代替一抗的陰性對照。以胞質(zhì)棕色著色為陽性細(xì)胞。應(yīng)用圖像掃描儀(中國山富)掃描圖像獲灰度均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行分析。對4組細(xì)胞凋亡率、p53和p21waf1 mRNA的表達(dá)及Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)行2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞凋亡率的比較 結(jié)果見表1。

表1 4組細(xì)胞凋亡率的比較(n=5) %

2.2 4組細(xì)胞p53和p21waf1m RNA表達(dá)的比較

結(jié)果見表 2、3。

表2 4組細(xì)胞p53mRNA表達(dá)的比較(n=6)

表3 4組細(xì)胞p21w af1m RNA表達(dá)的比較(n=6)

2.3 4組細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)的比較 結(jié)果見表4～6。

表4 4組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的比較(n=6)

表5 4組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的比較(n=6)

表6 4組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的比較(n=6)

3 討論

凋亡為細(xì)胞的主動性自殺過程。細(xì)胞凋亡主要有3條途徑:①通過 p53等抑癌基因的激活抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展并激活其下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。②通過線粒體途徑上調(diào)前凋亡蛋白 Bax,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2等的表達(dá)。③通過死亡受體如Fas-L的 Fas受體等[3]。前凋亡細(xì)胞通過蛋白裂解功能的Caspase的級聯(lián)反應(yīng),最后通過共同的Caspase-3途徑導(dǎo)致凋亡。Vargas等[4]報(bào)道在槲皮素抗黑色素瘤細(xì)胞增殖中 p53起中心作用。槲皮素可通過啟動p53,抑制NF-κB,阻抑細(xì)胞周期進(jìn)展和以線粒體為中介而誘導(dǎo)人宮頸癌 HeLa細(xì)胞凋亡[5]。Chou等[6]報(bào)道槲皮素誘導(dǎo)乳癌 MCF-7細(xì)胞凋亡是通過線粒體途徑及激活Caspase的級聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

該研究結(jié)果表明不但Br或nLQ可通過上調(diào)p53和p21waf1基因的表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá),提高凋亡率;而且nLQ及Br的聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。這與應(yīng)用非脂質(zhì)體槲皮素和Br誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)相符[7-8],提示nLQ和 Br可能各通過抑制不同的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而呈現(xiàn)互補(bǔ)的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

[1]Zhang XM,Huang SP,Xu Q.Quercetin inhibits the invasion ofmurinemelanoma B16-BL6 cells by decreasing pro-MMP9 via the PKC pathway[J].Cancer Chemother Pharmacol,2004,53(1):82

[2]Cheadle C,Nesterova M,Watkins T,et al.Regulatory subunits of PKA define an axis of cellular p roliferation differentiation in ovarian cancer cells[J].BMCMed Genomics,2008,1:43

[3]Gagiannis S,Mu ller M,Uhlemann S,et al.Parathyroid hormone-related protein confers chemoresistance by b locking apoptosis signaling via death receptors and m itochond ria[J].Int JCancer,2009,125(7):1551

[4]Vargas AJ,Sittadjody S,Thangasamy T,et al.Exploiting tyrosinase expression and activity in melanocytic tumors: quercetin and the central role of p53[J].Integr Cancer T-her,2010[Epub ahead of print]

[5]Vidya Priyadarsini R,Senthil Murugan R,Maitreyi S,et al.The flavonoid quercetin induces cell cycle arrest and m itochondria-mediated apoptosis in human cervical cancer (HeLa)cells through p53 induction and NF-kB inhibition [J].Eur JPharmacol,2010,649(1/3):84

[6]Chou CC,Yang JS,Lu HF,et al.Quercetin-mediated cell cycle arrest and apoptosis involving activation of a caspase cascade through them itochondrial pathway in human breast cancer MCF-7 cells[J].Arch Pharm Res, 2010,33(8):1181

[7]Wang HM,Zheng NG,Wu JL,etal.Dualeffects of 8-BrcAMP on differentiation and apoptosis of human esophageal cancer cell line Eca-109[J].World JGastroenterol,2005, 11(41):6538

[8]宮璀璀,王文麗,吳景蘭,等.8-Br-cAMP和槲皮素單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對Eca-109細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax、XRCC 1等凋亡相關(guān)蛋白的作用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2003,38(5):698