原志慶,崔 靜,千新來,賀國洋,鄭麗麗

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科鄭州 450052 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室新鄉(xiāng) 453003

#通訊作者,女,1956年6月生,教授,博士,主任醫(yī)師,研究方向:內(nèi)分泌疾病的防治,E-mail:zhengli1012@126.com

大腸癌的發(fā)生過程中涉及多種癌基因和(或)抑癌基因的變化。研究[1-4]表明,細(xì)胞周期相關(guān)基因p16、Rb和p27的失活與多種腫瘤有關(guān),它們的失活方式有缺失、突變和啟動子區(qū)甲基化等。DNA甲基化是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要方式之一,在限制或關(guān)閉基因表達(dá)中起重要作用。作者采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法檢測大腸癌組織中p16、Rb和 p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),并分析其甲基化狀態(tài)與蛋白產(chǎn)物的表達(dá)及大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集2001年1至 12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院、新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院和新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本 56例,腺瘤 42例,同時切取大腸癌患者手術(shù)切緣正常組織,所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)。56例大腸癌患者,男 31例,女 25例;年齡37～76(53.6±5.2)歲;高分化腺癌23例,中分化腺癌 30例,低分化腺癌 3例;浸潤至黏膜下層 24例,肌層 32例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 23例,無33例?；颊咝g(shù)前均未接收放療或化療。

1.2 主要試劑 亞硫酸鈉和氫醌等為美國Sigma公司產(chǎn)品;基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、dNTPs和Taq DNA聚合酶等為美國Promega公司產(chǎn)品;RNA酶A、蛋白酶K和瓊脂糖等為德國Merk公司產(chǎn)品;100 bp DNAMarker為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;氫氧化鈉為國產(chǎn)分析純;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 p16、Rb和p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測

1.3.1 基因組DNA的提取、修飾及純化 組織離體后立即提取基因組DNA,按基因組DNA提取試劑盒說明書操作并定量,然后按文獻(xiàn)[5]方法略作修改進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾:取2μg基因組DNA,于20μL氫氧化鈉(0.5mol/L)中37℃變性15min,加入30μL氫醌(10mmol/L)和520μL亞硫酸氫鈉(3 mol/L,pH 5.0)并混勻,50℃修飾16 h后,按說明書純化回收修飾的基因組DNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MSP 以經(jīng)過修飾并純化的基因組DNA為模板,采用MSP方法檢測各樣品中p16、Rb和p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。引物序列和產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;94℃變性45 s,60℃(p16U)或65℃(p16M)或55℃(RbM和RbU)或66℃(p27M和p27U)退火45 s,72℃延伸45 s,35個循環(huán);最后 72℃延伸 5 min。產(chǎn)物經(jīng) 18 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察并照相。

表1 引物序列和目的片段

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計分析,腺瘤與正常組織、不同臨床病理特征大腸癌組織間 3種基因甲基化率的比較采用 χ2檢驗(yàn),大腸癌與正常組織間 3種基因啟動子區(qū)甲基化率的比較采用配對χ2檢驗(yàn),大腸癌組織中 3種基因甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的分析采用列聯(lián)系數(shù)rp評價,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 p16、Rb和p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果 見圖1、表2。

2.2 大腸癌組織中p16、Rb和p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)的關(guān)系 見表 3。

圖1 p16(左)、Rb(中)和p27(右)基因啟動子區(qū)甲基化MSP檢測結(jié)果M:marker;1:甲基化;2:非甲基化。

表2 p16、Rb和p 27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 例(%)

表3 大腸癌組織中p 16、Rb和p 27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)的關(guān)系 例(%)

2.3 p16和p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表4。

表4 p 16和p 27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

3 討論

DNA甲基化可能通過直接和間接 2種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá),基因啟動子區(qū) CpG島的甲基化可干擾一些轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合或抑制 RNA聚合酶活性而直接抑制基因表達(dá);甲基化DNA與特異結(jié)合蛋白結(jié)合或甲基化改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)可間接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與 DNA結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄。近年來,基因啟動子區(qū)CpG島的高甲基化引起的腫瘤抑制基因失表達(dá)已成為腫瘤研究的焦點(diǎn)之一[6]。

作者采用MSP方法檢測了56例大腸癌和42例大腸腺瘤組織中p16、Rb和p27基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),并分析甲基化狀態(tài)改變與蛋白表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果顯示:腺瘤和癌組織中p16和 p27基因啟動子區(qū)甲基化率均顯著增加,而Rb基因啟動子區(qū)甲基化率無明顯增加,而且正常、腺瘤和癌組織中 Rb基因啟動子區(qū)均呈低水平的甲基化。p16和 p27基因啟動子區(qū)甲基化影響了其蛋白表達(dá),而 Rb基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)無關(guān)聯(lián)。提示大腸癌組織中啟動子區(qū)高甲基化是p16和p27基因失活的主要機(jī)制,抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化可能是腫瘤發(fā)生與演進(jìn)的重要事件[7]。但是,該研究結(jié)果還提示大腸癌組織中Rb基因啟動子區(qū)甲基化可能在Rb的失活中不起主要作用,深入的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等是評價腫瘤特別是惡性腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。該研究結(jié)果顯示:p16基因啟動子區(qū)高甲基化與大腸癌的分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切; p27高甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Arnold等[8]以具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的大腸癌為研究對象的結(jié)果也顯示p16可作為一個大腸癌的預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述,p16和 p27基因啟動子區(qū)高甲基化在大腸癌的發(fā)生、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移中可能起重要作用,兩者有可能成為大腸癌早期診斷和判斷預(yù)后的候選標(biāo)志物。

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