王明臣,蔣薇薇,張善鋒,王好東,宋 宇,趙 勤,董子明

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室鄭州 450001△男,1963年3月生,博士,教授,研究方向:腫瘤發(fā)生的分子機制及干預防治,E-mail:Wangm c@zzu.edu.cn

研究[1]表明,前列腺癌組織和前列腺癌細胞系存在DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)β的高表達。DNA polβ高表達介導過多的DNA低保真復制合成并由此導致基因組的不穩(wěn)定性增加和細胞的自發(fā)突變率升高可能是介導腫瘤發(fā)生及腫瘤化療中一些抗癌藥物耐受產生的重要分子機制[2-4]。因此,尋求有效干預 DNA polβ過表達并使其呈現(xiàn)適宜水平表達的線索和途徑,對于腫瘤的有效干預防治具有重要理論和實用意義。作者所在的課題組前期利用RNA干擾這一基因阻斷技術,以pSUPERneoGFP載體中的H1為啟動子, DNA polβ為靶基因,成功構建了2個DNA polβ靶向siRNA表達載體(pSUPERneoGFP-PS1和pSUPERneoGFP-PS2)[5]。該研究將其轉染人前列腺癌PC3細胞,觀察對DNA polβ高表達的沉默效應及不同程度抑制的DNA polβ功能狀態(tài)對PC3細胞生物學行為的影響,旨在揭示DNA polβ基因在細胞內的適宜表達和功能狀態(tài),為前列腺癌的干預防治提供新的思路及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和重組載體 人前列腺癌PC3細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。靶向DNA polβmRNA的siRNA表達載體1(pSUPER-neoGFP-PS1)和表達載體2(pSUPERneoGFP-PS2)以及對照siRNA表達載體pSUPERneoGFP-SC,由作者所在課題組構建保存[5]。

1.2 細胞分組 常規(guī)細胞培養(yǎng)。細胞轉染按 Invitrogen公司轉染試劑LipofectamineTM操作說明書進行,轉染后首先用 600 mg/L的 G418篩選,1～2 d后細胞大量死亡,僅余少量細胞,G418改為維持濃度 200mg/L,經過 2～3周逐漸形成抗性克隆,擴大培養(yǎng)得到穩(wěn)定轉染pSUPERneoGFP-PS1、pSUPERneoGFP-PS2、pSUPERneoGFP-CS和轉染空pSUPERneoGFP的細胞。各轉染細胞分別成組,并設未轉染 PC3細胞組,每組接種 6個復孔培養(yǎng)24 h。

1.3 各組PC 3細胞DNA polβm RNA檢測 采用RT-PCR法。DNA polβ上游引物5'-GAGAAG AACGTGAGCCAAGC-3'(189～208),下游引物5'-CATCCATGTCACCACTGGAC-3'(690～671),擴增片段大小 206 bp。內參 β-actin上游引物 5'-ACACTGTGCCCATCACGAGG-3'(555～575),下游引物5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3'(929～947),擴增片段大小520 bp。用Qiagen公司試劑盒提取細胞總RNA并經逆轉錄得cDNA。擴增反應體系30μL:cDNA 5μL,Mix(含人DNA polβ引物及內參引物各0.5μL,10×Buffer 3μL,5mmol/L 4× dTNP 1μL)6μL,Taq酶(1×106U/L)0.5μL,去離子水18.5μL。94℃預變性5m in;94℃變性50 s, 55℃復性 50 s,72℃延伸 60 s,三溫循環(huán) 35次;72℃末端延伸5 min。使用Syngene凝膠成像分析系統(tǒng),對擴增產物的電泳條帶進行灰度掃描,測定積分吸光度值(IA)。DNA polβmRNA的相對表達量以其IA與內參IA的比值表示。

1.4 各組PC3細胞DNA polβ蛋白的表達 采用Western b lot法。收集各組細胞,超聲破碎細胞, Bradford法測定蛋白含量,取50μg樣品,進行120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳;電轉到PVDF膜上,用含質量分數(shù)5%脫脂奶粉4℃封閉6 h;TTBS洗膜5 min×3次。加入山羊抗人(DNA polβ一抗工作濃度1∶200)室溫孵育1 h。TTBS洗膜5min×3次,室溫。加入堿性磷酸酶標記的相應的二抗(1∶500)平緩搖動孵育1 h,室溫。TTBS洗膜5min×3次。加入BCIP/NBT顯色液,避光30 min后,蒸餾水終止。

1.5 各組PC3細胞周期的測定 采用流式細胞儀檢測。取匯合度達 80%～90%的細胞,常規(guī)消化,PBS洗2遍。20 g/L多聚甲醛1 m L固定5 min,離心,PBS再洗 1遍。加胰蛋白酶液 250 μL,輕混,室溫放置10 min。加中和液200μL,輕混,室溫放置 10 m in。加 PI染料200μL,輕混, 2～8℃避光放置 10 min。用 300目尼龍網過濾樣品后上機,采用Cell Quest軟件分析圖像。資料用Madfit LT for Mac 3.0軟件分析處理,計算G0和G1期、S期、G2和M期PC3細胞百分率。

1.6 各組PC3細胞自發(fā)突變率的測定 采用體外哺乳類細胞次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine,HGPRT)基因突變試驗檢測。將5×105個待測細胞(轉染和未轉染的 PC3細胞)接種于培養(yǎng)瓶中,于37℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。進入對數(shù)生長期后,胰蛋白酶消化,加入含體積分數(shù) 10%胎牛血清培養(yǎng)液,混勻,放入離心管以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,制成細胞懸液并計數(shù)。以 6×106個細胞接種于直徑為100 mm的平皿中,培養(yǎng)基中含有0.5 g/L的6-硫代鳥嘌呤(6-TG),37℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng) 7 d,平行做 10個平皿。將上述首次消化計數(shù)后的細胞每平皿接種 200個,培養(yǎng)基中不含 6-TG,平行做 10個平皿,37℃、體積分數(shù)5%CO2條件下同樣培養(yǎng) 7 d。培養(yǎng)結束后,用乙醇-冰醋酸(體積比3∶1)固定,Giemsa染色,計數(shù)每皿集落數(shù)。集落形成率 =實際存活的細胞集落數(shù)/接種細胞數(shù)。自發(fā)突變率 =突變集落數(shù) ×集落形成率/接種細胞數(shù) ×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 12.0分析。各組PC3細胞DNA polβmRNA和蛋白表達、細胞周期以及自發(fā)突變率的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組PC3細胞DNA po lβ的mRNA及蛋白表達的變化及細胞周期 見圖1和表 1。

2.2 各組PC3細胞自發(fā)突變率的變化 見表2。

圖1 各組PC 3細胞中DNA polβ蛋白的表達1:轉染pSUPERneoGFP-PS1組;2:轉染pSUPERneoGFP-PS2組;3:轉染pSUPERneoGFP-CS組;4:轉染空pSUPERneoGFP組;5:未轉染組。

表1 各組PC 3細胞po lβm RNA的表達水平比較

表2 各組PC 3細胞自發(fā)突變率比較

3 討論

研究[6]顯示,前列腺癌組織及人前列腺癌 PC3細胞系存在DNA polβ的高表達。DNA polβ過表達可導致復制的錯配率增加并由此引發(fā)基因組的不穩(wěn)定性升高,可能是除 polβ基因突變以外,介導腫瘤發(fā)生的另一重要分子機制。該結果顯示:與轉染siRNA對照(pSUPERneoGFP-CS)、轉染空siRNA載體及未轉染的PC3細胞相比,轉染polβ靶向siRNA載體的PC3細胞,DNA polβ無論mRNA水平抑或蛋白水平的表達均受到顯著抑制,且pSUPERneoGFP-PS1的沉默抑制作用強于pSUPERneoGFP-PS2,幾近完全抑制。表明短發(fā)卡狀polβ靶向siRNA能快速有效、特異性地封閉DNA polβ的表達。其機制在于polβ靶向siRNA載體導入前列腺癌PC3細胞后,在體內迅速轉錄產生短發(fā)卡RNA結構,并在dsRNA特異性核酸內切酶的作用下加工成為19 bp大小的siRNA,引發(fā)轉錄后基因沉默。表現(xiàn)為與未轉染的PC3細胞、轉染空載體和轉染對照pSUPER-neoGFP-CS的PC3細胞相比,呈現(xiàn)部分抑制的轉染pSUPERneoGFP-PS2細胞的S期比例明顯降低,對應的細胞自發(fā)突變率亦顯著降低。而 polβ表達幾乎完全抑制的轉染pSUPERneoGFP-PS1細胞的S期比例反而顯著增加,自發(fā)突變率亦顯著升高。提示DNA polβ的過表達或表達完全“敲除”均有利于細胞的惡性轉化,即細胞正常的分裂增殖及細胞基因組穩(wěn)定性的維持依賴適宜的低濃度的DNA polβ的存在。

總之,作者利用RNA干擾技術對polβ基因的功能狀態(tài)研究揭示,細胞內維持polβ所呈現(xiàn)的DNA損傷修復酶和聚合酶兩種酶活性的適宜比例可能是非常重要的。尋求一些能夠有效調控細胞該酶兩種活性時相和消長關系的線索和手段可能是有效干預細胞惡性轉化的新途徑。

[1]王明臣,唐琳,趙國強,等.前列腺癌及良性前列腺增生組織中DNA聚合酶β、PTEN及Ha-ras基因mRNA檢測[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2005,40(4):613

[2]Canitrot Y,Cazaux C,Frechet M,et al.Overexp ression of DNA polymerasebeta in cell results in amutator phenotype and a decreased sensitivity to anticancer drugs[J].Proc Natl Acad Sic USA,1998,95(21):12586

[3]Bergolio V,Pillaire MJ,Lacroix-Trikim M,et al.Deregulated DNA polymerase beta induces chromosome instability and tumorigenesis[J].Cancer Res,2002,62(12):3511

[4]Servant L,Bieth A,Hayakawa H,et al.Involvement of DNA polymerase beta in DNA rep lication and mutagenic consequences[J].JMol Biol,2002,315(5):1039

[5]王明臣,唐琳,趙國強,等.前列腺癌及良性增生組織中DNA聚合酶β基因突變檢測[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2006,40(4):611

[6]王明臣,宋宇,張善鋒,等.前列腺癌特異突變 DNA聚合酶 β真核表達載體構建及鑒定[J].中國老年學雜志2009,29(14):1758