王義生,張 振,張 鑫,趙國強,李月白

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科鄭州 450052 2)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學教研室鄭州 450001 3)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室鄭州 450001

△男,1951年2月生,教授,研究方向:骨壞死的發(fā)病機制與防治、關(guān)節(jié)脊柱外科,E-mail:wangyisheng@zzu.edu.cn

股骨頭壞死是危害人類健康的重要疾病之一,而酒精性股骨頭壞死的發(fā)病率居高不下。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潛能,其分化方向受多種神經(jīng)遞質(zhì)的影響。作者收集兔BMSCs,利用第3代細胞觀察乙醇干預后其成纖維細胞生長因子(fibrocyte growth factor,FGF)、降鈣素相關(guān)基因肽受體(calcitontin gene-related peptide receptor,CGRPR)、血管活性腸肽受體(vasoactive intestinal peptide recep tor, VIPR)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、P物質(zhì)受體(substance P receptor,SPR)及過氧化物酶體增殖子活化受體-γ(peroxisom proliferator-activated receptorγ,PPARγ)等基因的表達情況,探討神經(jīng)遞質(zhì)對成骨作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:6周齡新西蘭大耳白兔(河南省實驗動物中心)。儀器:25m L培養(yǎng)瓶(寶信生物工程公司),PCR儀(美國Biometra公司),超凈工作臺(蘇州凈化公司),倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司),u-2001型紫外分光光度儀(美國Stanorjus公司)。試劑:低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),RNA提取試劑盒(Fermentas公司),無水乙醇(北京化工廠),Trizol試劑(美國Invitrogen公司),SYBR 熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司提供,序列見表 1。

1.2 BM SCs的分離與鑒定 空氣栓塞法處死大耳白兔,充分洗凈后使用體積分數(shù) 75%醫(yī)用乙醇完全浸泡15 min以達到消毒目的,移至超凈工作臺,常規(guī)消毒鋪巾,嚴格無菌操作下取家兔四肢長骨,咬骨鉗咬斷其兩端干骺端,使用10m L針管,以無血清低糖DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 kU/L,鏈霉素100 mg/L,維生素C 50 mg/L,L-谷氨酰胺1 mmol/L, Hepes 20 mmol/L)沖洗髓腔,將骨髓沖至無菌培養(yǎng)皿中,取一離心管加入10mL淋巴細胞分離液,骨髓鋪于分離液上層,室溫下1 700 r/min離心20 min,取其中間白膜單核細胞層至離心管中,加入培養(yǎng)基至5 mL,吹打混勻后1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入完全DMEM培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清)4 mL,反復吹打混勻后以1×106cm-2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中[1]。取原代細胞行免疫細胞化學染色,結(jié)果CD29、CD44、CD105及CD166表達陽性而CD11、CD14、CD34及CD45表達陰性,再根據(jù)BMSCs排除鑒定法[2],鑒定為BMSCs。原代細胞培養(yǎng)3 d后進行首次換液,以后每隔2 d換液 1次,逐日用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)及生長情況,待細胞長至瓶底面積的70%～80%時消化傳代。

表1 引物序列

1.3 實驗分組及處理 取第3代細胞隨機分為2組,以 1×104m L-1分別接種于 6孔培養(yǎng)板中。實驗組于培養(yǎng)基中加入乙醇至終濃度達0.09mol/L,對照組正常培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第 4和 7天,檢測相關(guān)基因的表達。重復 5次。

1.4 BMSCs中FGF、CGRPR、VIPR、NGF、SPR及PPARγ等m RNA的檢測 以Trizol法提取細胞總RNA,經(jīng)RNA純度和完整性鑒定后,用通用引物在AMV的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,行RT-PCR檢測。使用熒光定量PCR進行定量檢測,具體反應體系:SYBR Premix ExTaq 12.5μL,上、下游引物各0.5μL,cDNA 2μL,去離子水9.5μL。擴增條件為:95℃30 s,95℃25 s,60℃30 s,40個循環(huán)。以目的基因和內(nèi)參照基因β-actin的標準品測定所得的標準曲線,計算出mRNA的絕對含量,用目的基因與β-actin的mRNA絕對含量的比值表示目的基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析,2組BMSCs中各基因mRNA相對表達量的比較采用兩獨立樣本t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

FGF、CGRPR、VIPR、NGF、SPR及PPARγ等mRNA的檢測結(jié)果見圖 1和表 2、3?？梢钥闯?實驗組BMSCs中NGF、FGF、CGRPR、VIPR和SPR mRNA的相對表達量較對照組明顯降低,而PPARγ mRNA的相對表達量較對照組顯著增高。

圖1 2組BM SCs中幾種神經(jīng)遞質(zhì)mRNA的RT-PCR結(jié)果S:實驗組;D:對照組;M:Marker;1:CGRPR;2:NGF;3:SPR;4:VIPR;5:FGF;6:β-actin;7:PPARγ。

表2 2組細胞培養(yǎng)第4天各基因mRNA的表達

表3 2組細胞培養(yǎng)第7天各基因m RNA的表達

3 討論

BMSCs能夠分化為成骨細胞,在骨愈合中起重要作用,又可被不同的因素誘導分化為軟骨細胞、神經(jīng)細胞和脂肪細胞等。多項研究[2-4]證實 NGF、FGF、CGRP、VIP和SPR有促進MSCs增殖、成骨分化的作用。近年來,神經(jīng)系統(tǒng)與成骨的相關(guān)性已經(jīng)引起重視。Solchaga等[5]證明,FGF-2具有增強人BMSCs增殖和延遲其成骨能力喪失的作用。張貴春等[6]發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)可以促進成骨細胞的生成,從而加速骨折愈合。高潤等[7]證實神經(jīng)系統(tǒng)對于骨代謝有著重要影響。劉勇等[8]認為 NGF、CGRP、SPR及VIP等神經(jīng)遞質(zhì)可以通過促進成骨細胞生成、抑制破骨細胞,促進成骨過程。研究[9]證明,乙醇處理BMSCs7 d,成骨基因骨鈣素表達顯著降低,成脂基因PPARγ呈高表達,導致機體成骨下降,成脂增多。因此,該研究觀察了乙醇處理 BMSCs 4、7 d后相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)mRNA的表達。

長期大量飲酒能夠引起股骨頭壞死。王義生等[10]證實乙醇能夠誘導小鼠骨髓基質(zhì)細胞大量分化為脂肪細胞,成骨分化減少,導致股骨頭內(nèi)脂肪堆積,骨內(nèi)壓增高,血流減少,從而引起股骨頭壞死。吳學建等[11]發(fā)現(xiàn)乙醇能夠誘導人BMSCs中PPARγ表達增強,骨鈣素表達減弱,PPARγ是酒精性股骨頭壞死的重要致病基因之一。

作者采用新西蘭大耳白兔第3代BMSCs,給予0.09mmol/L乙醇4、7 d后進行相關(guān)遞質(zhì)mRNA的檢測,結(jié)果顯示,BMSCs中FGF、CGRPR、VIPR、NGF及SPRmRNA的表達明顯降低,而PPARγmRNA的表達顯著增高。由此推測,在乙醇作用下,BMSCs中FGF、CGRPR、VIPR、NGF及SPR的促成骨作用將被抑制,而PPARγ促使BMSCs大量分化為脂肪細胞,從而發(fā)生股骨頭壞死。

[1]Zhang Cailong,Xia Changsuo,Jiang Zhengyao.Isolation of rabbitbone marrow mesenchymal stem cells using density gradient centrifugation and adherence screening methods [J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(6):1181

[2]蔣柳宏,鄭有華,張志光,等.bFGF基因轉(zhuǎn)染對兔骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響[J].中山大學學報:醫(yī)學科學版,2009,30(4):41

[3]韓慶林,茍三懷,王琪,等.降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)調(diào)控成骨細胞功能研究進展[J].中國矯形外科雜志, 2005,13(7):544

[4]張為西,陳松林,姚曉黎,等.BMP-2和FGF-2對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的影響[J].細胞與分子免疫學雜志,2008,24(11):1062

[5]Solchaga LA,Penick K,Goldberg VM,etal.Fibroblastgrowth factor-2enhances proliferation and delays lossof chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells[J].JCell Physoil,2005,203(2):389

[6]張貴春,李金松.周圍神經(jīng)系統(tǒng)與骨折愈合[J].中國矯形外科雜志,2008,16(24):1876

[7]高潤,阮德明.神經(jīng)損傷對骨代謝影響的實驗研究[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2006,9(6):55

[8]劉勇,裴國獻.周圍神經(jīng)因素與骨和組織工程骨[J].國際骨科雜志學,2006,27(1):12

[9]王義生,王少華,王興,等.siRNA阻斷PPARγ基因表達預防酒精性股骨頭壞死的實驗研究[J].河南醫(yī)學研究,2010,19(2):138

[10]Wang YS,LiY,Mao K,etal.Alcohol-induced adipogenesis in bone and marrow:a possiblemechanism for osteonecrosis[J].Clin Orthop Relat Res,2003(410):213

[11]吳學建,尹萬樂,李月白,等.乙醇對人骨髓間充質(zhì)干細胞成脂轉(zhuǎn)錄因子γ和骨鈣素mRNA表達的影響[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2006,41(6):1098