李敏晶,韓艷玲,譚成玉,劉遠

(1.大連海洋大學海洋環(huán)境工程學院,遼寧大連116023;2.大連海洋大學遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學與技術重點實驗室,遼寧大連116023)

不同提取方法對海燕皂苷抗氧化活性的影響

李敏晶1、2,韓艷玲1,譚成玉1、2,劉遠1、2

(1.大連海洋大學海洋環(huán)境工程學院,遼寧大連116023;2.大連海洋大學遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學與技術重點實驗室,遼寧大連116023)

采用微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法和索氏萃取法分別提取海燕Asterina pectinifera總皂苷,用大孔樹脂柱層析法對總皂苷進行分離提純,并將分離提純后得到的海燕皂苷樣品與分離前的總皂苷樣品的抗氧化活性進行了測定。結果表明:用不同提取方法所得的海燕皂苷在分離前后抗氧化活性不同,分離純化后的皂苷樣品抗氧化活性較好;3種提取法中用微波輔助萃取法所得海燕皂苷樣品的抗氧化活性最好。

海燕;皂苷;微波輔助萃取法;超聲波輔助萃取法;索氏萃取法

海燕Asterina pectinifera是中國黃海沿海十分常見的棘皮動物。海燕體呈五星型,反口面隆起為藍紫色,其間鑲有紅色斑紋,生活時口面為橘黃色,其資源十分豐富[1]。海星綱海燕科動物含有大量結構獨特的具有生物活性的代謝產物,如皂苷、生物堿、甾醇、多糖、維生素、蛋白質、多肽和氨基酸等,它們具有多種多樣的生理和藥理活性,如抗癌、抑菌、抗病毒、抗炎、降血壓和降血脂等,因此,其在醫(yī)藥、保健食品及動物飼料資源開發(fā)等領域中有著巨大的應用前景[2]。海燕皂苷與植物皂苷一樣均屬于極性較大的分子,易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑,不易溶于氯仿、乙醚等非極性溶劑。目前,關于海燕皂苷類化合物的提取方法很多[3-6]。本試驗中,作者采用微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法和索氏萃取法分別提取海燕Asterina pectinifera總皂苷,用大孔樹脂柱層析法對總皂苷進行分離提純,并將分離提純后得到的海燕皂苷樣品與分離前的總皂苷樣品的抗氧化活性進行了測定,以期為海燕皂苷的藥物開發(fā)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

試驗用海燕采自大連黑石礁海域。

試驗儀器主要有:紫外-可見分光光度計(OPTIZEN2620UV型)、可見分光光度計(721型)、電熱恒溫水浴鍋(SY2-4型)、真空干燥箱(DZF-6020型)、冷凍干燥機(ChristAlpha1-2型)、數(shù)顯酸度計(PHS-25C型)、旋轉蒸發(fā)儀(RE-52CS型)、電子天平(ALC-1104型)、溶劑過濾器(B-50型)。

二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)、維生素C (Sigma公司)、鄰苯三酚等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 海燕皂苷的制備 分別采用微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法和索氏萃取法對海燕樣品中總皂苷進行提取(以乙醇為溶劑),將提取液濃縮后經(jīng)冷凍干燥得到海燕總皂苷樣品。

選用D-101型大孔樹脂,以體積分數(shù)為70%的乙醇作為洗脫劑,分別將三種提取方法所得到的海燕總皂苷樣品進行分離純化,每種提取方法分別純化得到兩種不同的皂苷樣品Ⅰ和Ⅱ。將所有的海燕皂苷樣品進行編號,具體見表1。

表1 海燕皂苷樣品編號Tab.1 The number of the tested samples

1.2.2 海燕皂苷對DPPH·的清除作用 取表1中所列9種海燕皂苷樣品,分別配成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液,加入2 mL 0.2 μmol/L DPPH·溶液,搖勻,室溫下避光反應30 min,在517 nm處測其吸光度Ai,同時測定2 mL 0.2 μmol/L DPPH·溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度值Aj,以及未加樣品液時2 mL無水乙醇加2 mL DPPH·溶液的吸光度值Ac,分別計算9種樣品對DPPH·清除率。計算公式如下:

1.2.3 清除DPPH·的反應動力學研究 將2 mL不同濃度的1、2、3號皂苷樣品與2 mL DPPH·標準液反應,每間隔5 min記錄1次A值,連續(xù)30 min,測定不同反應時間下的吸光度。以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標,繪制不同濃度的樣品與DPPH·反應隨時間推移的動力學關系曲線圖。

1.2.5 海燕皂苷對·OH自由基的清除作用 在試管中加入1.0 mL 7.5 mmol/L的鄰二氮菲水溶液、2.0 mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖液和1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4水溶液,然后再分別加入1.0 mL體積分數(shù)為0.1%的H2O2水溶液(損傷管s)、1.0 mL體積分數(shù)為0.1%的H2O2水溶液和1.0 mL濃度為0.8 mg/mL海燕皂苷水溶液(樣品管y)、1.0 mL體積分數(shù)為0.1%H2O2水溶液和1.0 mL濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的Vc水溶液(參照管c),以不加H2O2和樣品液的作為空白管(k);各管均用蒸餾水定容至10 mL,搖勻,于37℃下反應1 h,以pH為7.4的磷酸鹽緩沖液2.0 mL和8.0 mL雙蒸水混勻作為空白參照管,于536 nm波長下測定各管液體的吸光度,按下式計算清除率:

2 結果與分析

2.1 海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ對DPPH·的清除率

將海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ對DPPH·的清除率結果繪制成圖1。由圖1可知,采用3種提取方法所得的海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ樣品對DPPH·均有一定的清除作用,且隨著海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ濃度的增加,其對DPPH·的清除率增大?？梢娞崛悠返目寡趸钚耘c海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ的濃度均呈量效關系。其中,用微波輔助萃取法提取的海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ樣品的抗氧化能力最強,用索氏萃取法提取的樣品次之,而采用超聲波輔助萃取法提取的樣品最弱。這說明海燕皂苷抗氧化活性的強弱與其提取方法有一定的關系。本研究中,采用微波輔助萃取法對于皂苷抗氧化活性保持的效果最好。其原因可能是,采用微波萃取法可避免樣品長時間或在過高的溫壓下分子結構被分解和破壞,因此對于皂苷樣品的抗氧化活性保持的效果最好。

2.2 清除DPPH·的反應動力學的研究

將微波輔助萃取法所得總皂苷(1號)、皂苷Ⅰ(2號)、皂苷Ⅱ(3號)3種海燕皂苷樣品與DPPH·自由基反應隨時間推移的動力學關系分別繪制成圖2。由圖2可知,1、2、3號皂苷樣品均隨著時間的延長吸光度值逐漸降低,樣品濃度越高其吸光值降低也越快。此規(guī)律說明:3種皂苷樣品均具有明顯的清除DPPH·自由基的效果;皂苷的含量越高,清除自由基的能力越強。

另外,將反應20 min的3種皂苷樣品清除DPPH·的吸光度值繪制成圖3。由圖3可知,分離前的總皂苷樣品和分離后的皂苷樣品Ⅰ、Ⅱ,吸光度值大小在相同濃度下相差較大,說明分離后的皂苷樣品Ⅰ、Ⅱ清除DPPH·的能力更強。而皂苷Ⅰ和皂苷Ⅱ兩種樣品對DPPH·的清除效率相差較小。

圖1 海燕總皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ對DPPH·的清除率Fig.1 DPPH·clearance by the total saponins,saponinsⅠ,and saponinsⅡbefore separation

圖2 1、2、3號樣品清除DPPH·的反應動力學曲線Fig.2 Kinetic curve of DPPH·clearance by sample saponins No.1,No.2,and No.3

圖3 反應20 min時3種皂苷樣品的吸光度Fig.3 Absorption of 3 saponin samples with reaction of 20 min

2.4 皂苷樣品對·OH的清除率

由圖5可知,海燕皂苷樣品對·OH的清除率規(guī)律基本上與對·O的清除率結果一致。

圖4 海燕皂苷樣品對·O的清除率Fig.4 ·Oclearance by saponin samples

圖5 海燕皂苷樣品對·OH的清除率Fig.5 ·OH clearance by saponin samples

3 結論

1)采用微波輔助萃取法、超聲波輔助萃取法和索氏萃取法提取的海燕皂苷9種樣品均具有較為顯著的抗氧化活性,且9種樣品的抗氧化活性強弱與海燕皂苷的濃度大小呈量效關系。

2)海燕皂苷的抗氧化活性強弱與其提取方法有一定的關系。用微波法輔助萃取法得到的海燕皂苷樣品抗氧化活性最強,其次是索氏萃取法,用超聲波輔助萃取法得到的海燕皂苷樣品抗氧化活性最弱。

3)本研究中涉及的9種海燕皂苷樣品可分為三類,即海燕總皂苷樣品、皂苷Ⅰ和皂苷Ⅱ。經(jīng)提純分離后的皂苷Ⅰ和皂苷Ⅱ的抗氧化活性顯著優(yōu)于分離前的海洋總皂苷樣品的抗氧化活性。

[1] 任虹,遲安政,陳倩潔,等.海燕Asterina pectinifera生殖腺營養(yǎng)成分的研究[J].中國海洋藥物,2002(6):32-34.

[2] 王洪欣,張立新.海星中皂苷類化學成分的研究進展[J].天然產物研究與開發(fā),2005,17:96-103.

[3] Kicha A A,Ivanchina N V,Stonik V A.Seasonal variation in the levels of polyhydroxysteroids and related glycosides in the digestive tissues of the starfish Patiria(Asterina pectinifera)[J].Comparative Biochemisty and Physiology,2003,136:897-903.

[4] 文震,黨志,宗敏華,等.超臨界CO2萃取海星皂苷[J].精細化工,2006,23(7):657-660.

[5] 李敏晶,韓艷玲,周月,等.正交設計優(yōu)化海燕總皂苷的微波提取工藝[J].廣東化工,2010,37(7):19-20.

[6] 李敏晶,韓艷玲,劉遠,等.超聲波提取法對海燕總皂苷提取工藝的研究[J].廣東化工,2010,37(8):69-70.

Effects of different extraction methods on antioxidant activity of asterosaponin in starfish Asterina pectinifera

LI Min-jing1,2,HAN Yan-ling1,TAN Cheng-yu1,2,LIU Yuan1,2
(1.School of Marine Environmental Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Laboratory of Offshore Marine Environmental Science and Technology,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Asterosaponin were extracted from starfish Asterina pectinifera by microwave-assisted extraction(MAE), ultrasonicwave-assisted extraction(UAE)and soxhlet extraction method,then isolated and purified by macroporous resin purification method.The antioxidant activity of each asterosaponin was analyzed.The results showed that the antioxidant activity of the asterosaponin was found to be varied with the extraction methods.The maximal antioxidant activity was observed in the purified asterosaponin extracted by MAE.

Asterina pectinifera;saponins;microwave-assisted extraction;ultrasonic wave-assisted extraction; soxhlet extraction method

O629.13

A

2095-1388(2011)04-0344-04

2010-10-13

遼寧省教育廳高等學校科研計劃項目(2009A177)

李敏晶(1976-),女,博士,副教授。E-mail:minjingli@dlou.edu.cn