王斌,程振遠(yuǎn),王惠,張興,周雅飛,周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室,遼寧大連116023)

沿海灘涂鎘吸附細(xì)菌的分離、鑒定及生長特性的研究

王斌,程振遠(yuǎn),王惠,張興,周雅飛,周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室,遼寧大連116023)

采用常規(guī)細(xì)菌分離技術(shù)從沿海灘涂的泥樣中分離出兩株對重金屬Cd2+具有吸附作用的細(xì)菌(編號為J2和J6),并采用原子吸收法測定了菌株及培養(yǎng)液中Cd2+的含量。結(jié)果表明:兩株菌在培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后,上清液中Cd2+的含量與對照組相比顯著降低(P＜0.05),菌體細(xì)胞中Cd2+含量與對照組相比顯著增加(P＜0.05);電鏡下觀測,兩株菌均為短桿狀,革蘭氏染色為陰性,有鞭毛。生理生化特征測定結(jié)果顯示,兩株菌均符合弧菌屬的特征,用O/129紙片測試為敏感,TCBS中生長變?yōu)辄S色,與過氧化氫酶、氧化酶、硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性,生長均需要Na+。結(jié)合16S rDNA序列分析,J2菌株被鑒定為Vibrio pacinii,J6菌株被鑒定為溶藻弧菌Vibrio alginnolyticus。J2菌株生長的最適pH為7,溫度為20℃,NaCl為30 g/L;J6菌株生長的最適pH為7.5,溫度為30℃,NaCl為40 g/L。

鎘;細(xì)菌吸附;細(xì)菌鑒定;生長特性

由于鎘具有抗腐蝕性及耐摩擦性,其用途涉及電鍍、油漆、電器制造、航空、材料等諸多領(lǐng)域,因而環(huán)境中的鎘污染不斷加劇[1]。目前鎘污染的治理越來越受到重視,其中采用微生物修復(fù)或治理鎘污染土壤的研究成為關(guān)注的熱點。生物修復(fù)是利用天然存在的植物或微生物在可控條件下對污染物進行轉(zhuǎn)化或降解、降低或消除的過程[2]。劉愛民等[3]從冶煉廠的污染土壤中篩選耐鎘細(xì)菌用于吸附鎘,并研究了其機理及在鎘污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。目前沿海灘涂重金屬污染愈加嚴(yán)重,但相關(guān)的微生物修復(fù)研究較少。本研究中,作者從沿海灘涂泥樣中分離出對鎘具有較明顯吸附作用的細(xì)菌,旨在為海洋鎘污染的微生物治理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》[4]的要求,用采泥器采集盤錦沿海灘涂表層的泥樣,放入滅菌袋于15℃下保存,24 h內(nèi)帶回實驗室進行常規(guī)處理。采用2216E培養(yǎng)基分離細(xì)菌,用常規(guī)鑒定培養(yǎng)基進行生化鑒定。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化 取10 g泥樣加入到盛有90 mL滅菌海水的錐形瓶(裝有玻璃珠)中振蕩20 min,逐級稀釋至10-7。分別取稀釋度為10-5、10-6、10-7的樣品懸液0.1 mL滴加到2216E培養(yǎng)基平板中央進行涂布,然后置于培養(yǎng)箱(26℃)中培養(yǎng)24 h。經(jīng)多次劃線分離與純化獲得單菌落。挑取單菌落在鏡下觀察個體形態(tài),結(jié)合菌落形態(tài)特征,確定為純培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)接到2216E斜面培養(yǎng)基上,15℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重金屬吸附菌的篩選 配制2216E液體培養(yǎng)基,每瓶加入49 mL。滅菌后在超凈工作臺上用5 mL一次性注射器吸取1 mL CdCl2·2H2O溶液(0.55 mg/mL,通過一次性濾器除菌)加入到培養(yǎng)液中,使Cd2+的終濃度為11 mg/L;然后用接種環(huán)接種分離菌株斜面培養(yǎng)物(26℃,24 h)一環(huán)到培養(yǎng)基中[4],每種菌接種2瓶。設(shè)置2個對照組,對照組1加入等量的Cd2+,但不接入細(xì)菌;對照組2只接入細(xì)菌,但不加入重金屬。26℃下以130 r/min搖床培養(yǎng)7 d。采用火焰原子吸收光譜法測定上清液中及細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)Cd2+的濃度,重復(fù)測定3次,挑選出上清液中Cd2+濃度顯著降低且細(xì)菌細(xì)胞中Cd2+濃度增加的菌株作為具有吸附能力的目標(biāo)菌。

1.2.3 樣品的處理及測定 采用原子吸收光譜法測定Cd2+的含量[4-5],具體方法如下:將加有Cd2+的細(xì)菌培養(yǎng)液以3 000 r/min離心15 min,得到上清液和沉淀。在沉淀中加入PBS以3 000 r/min離心15 min,洗滌3次,再將兩者分別倒入坩堝中,烘干后在馬福爐(500℃)中灰化2 h,將坩堝置于電熱板(溫度為80～100℃)上加熱,同時向坩堝中加入濃HNO3(約5 mL),待濃HNO3消耗完之前再加入雙氧水,直至烘干。然后在每個樣品中加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為4%的HNO3,溶解后用原子吸收分光光度計測定樣品中Cd2+的含量。

1.2.4 菌株的鑒定 將分離的菌株在2216E平板上劃線培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)特征并取單菌落,經(jīng)革蘭氏染色,油鏡下觀察菌體的形態(tài);同法培養(yǎng)后于電鏡下觀察形態(tài)。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]進行生理生化特性鑒定,用常規(guī)方法提取細(xì)菌DNA測定16SrDNA序列(寶生物大連有限公司),并用軟件MEGA4進行同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5 菌株生長特性試驗 1)pH對菌株生長的影響。將2216E液體培養(yǎng)基(10 mL/管)中的pH分別設(shè)置為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,每個pH梯度設(shè)3管重復(fù),分別接種活化24 h的液體菌種0.1 mL,于26℃下培養(yǎng)48 h,用754型紫外可見分光光度計測定其生長狀況。

2)NaCl濃度對菌株生長的影響。將2216E液體培養(yǎng)基(10 mL/管)中NaCl的濃度分別設(shè)置為10、20、30、40、50 g/L,pH分別設(shè)定為7.0和7.5。用上述方法培養(yǎng),并用754型紫外可見分光光度計測定其生長狀況。

3)溫度對菌株生長的影響。采用試驗得出的最適pH值和NaCl濃度,溫度分別設(shè)置為15、20、25、30、37℃。用上述方法培養(yǎng)后并用754型紫外可見分光光度計測定其生長狀況。

2 結(jié)果

2.1 重金屬吸附菌的篩選結(jié)果

從灘涂泥土中共分離得到8株細(xì)菌,經(jīng)過對鎘的吸附試驗,發(fā)現(xiàn)其中2株菌對Cd2+的吸附性能明顯(編號為J2、J6),其他6株未見明顯的吸附作用。J2和J6菌株部分生化特征具體測定結(jié)果見表1。從表2可見:試驗組上清液中Cd2+含量顯著降低(P＜0.05),而菌體細(xì)胞中Cd2+含量顯著增加(P＜0.05)。再根據(jù)公式:去除率=(對照1組上清液Cd2+含量-試驗組上清液Cd2+含量)/10× 100%,得到培養(yǎng)液中J2和J6兩種菌株對Cd2+的去除率分別為37%和42%。

表1 J2、J6菌株的部分生化特征Tab.1 Some biochemical characteristics of strains J2 and J6

表2 用J2、J6菌株處理后Cd2+的含量Tab.2 Cd2+contents in the medium treated by strains J2 and J6mg/L

2.2 J2、J6菌株的形態(tài)觀察和生化特性試驗

J2菌株的菌落呈圓形,邊緣整齊,表面光滑,無隆起;革蘭氏染色為陰性,菌體呈短桿狀,直或稍彎曲,具單極生鞭毛(圖1-a)。用O/129紙片測試為敏感,過氧化氫酶、氧化酶、脂酶反應(yīng)為陽性,生長需要Na+,硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性。根據(jù)上述特征等判斷,J2菌株與弧菌屬的生化特征相符(表1),但與其中所列種的指標(biāo)不完全吻合,其種的分類位置有待于進一步研究。

J6菌株的菌落邊緣不整齊,無隆起,形態(tài)不規(guī)則;革蘭氏染色為陰性,菌體呈短桿狀,直或稍彎曲,具周身鞭毛(圖1-b)。用O/129紙片測試為敏感,過氧化氫酶、氧化酶、脂酶反應(yīng)為陽性,生長需要Na+,能夠利用D-甘露醇、L-谷氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸,不能利用D-山梨醇等。根據(jù)上述特征判斷,J6菌株與溶藻弧菌Vibrio alginolyticus的生化特征相符。

圖1 電鏡下觀察J2、J6菌株的形態(tài)Fig.1 Morphology of strains J2 and J6 under electron microscope

2.3 J2、J6菌株的分子鑒定

J2、J6菌株的16S rDNA序列測定結(jié)果見圖2和圖3。同源比對結(jié)果表明:J2菌株與弧菌屬的Vibrio pacinii strain LMG 19999同源性為99%,J6菌株與溶藻弧菌同源性為99%。

圖2 J2菌株16S rDNA序列的測定結(jié)果Fig.2 16S rDNA sequence of strain J2

根據(jù)J6菌株的16S rDNA序列與相關(guān)屬種16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4,可見J6菌株與溶藻弧菌聚為一支,說明J6菌株與溶藻弧菌親緣關(guān)系最近,可將其鑒定為溶藻弧菌;J2菌株與Vibrio pacinii strain LMG 19999聚為一支,說明J2菌株與Vibrio pacinii strain LMG 19999的親緣關(guān)系最近,可將其鑒定為Vibrio pacinii strain LMG 19999[7]。

2.4 J2、J6菌株的生長特性

J2、J6菌株生長的最適pH分別為7.0和7.5,最適NaCl濃度分別為30 g/L和40 g/L,最適生長溫度分別為20℃和30℃。

圖3 J6菌株16S rDNA序列的測定結(jié)果Fig.3 16S rDNA sequence of strain J6

圖4 J2、J6菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains J2 and J6

3 討論

近年來,關(guān)于酵母菌、細(xì)菌和霉菌吸附重金屬離子的現(xiàn)象和機理研究的較多[8-12]。修復(fù)重金屬污染的細(xì)菌多分離自重金屬污染的土壤或工業(yè)廢水,用于海水重金屬污染修復(fù)的微生物報道很少。本試驗中篩選出的兩株菌對Cd2+都具有較好的吸附性能,具體表現(xiàn)為培養(yǎng)7 d后,培養(yǎng)液中Cd2+的濃度均顯著下降(P＜0.05),同時菌體細(xì)胞中的Cd2+濃度增加,說明一部分的Cd2+被吸附到了菌體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)。由于在樣品處理過程中菌體所帶的Cd2+和進入細(xì)胞內(nèi)Cd2+無法區(qū)別,有關(guān)吸附以及吸附后的轉(zhuǎn)化途徑有待深入研究。

對所獲得的J2、J6菌株進行生理生化鑒定及16S rDNA序列測定,確定這兩株菌同為弧菌屬,其中J2菌株生理生化特征與弧菌屬中所有菌種均不符合,16S rDNA序列測定與基因Bank中Vibrio pacinii同源性達99%;V.pacinii為Thompson在2001年提交的新種,來源為采自山東的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。目前僅見Gomez-Gil等[7]對V.pacinii的生化特性進行了測定,并進行了16S rDNA的分子鑒定,結(jié)果顯示,V.pacinii與已知的弧菌屬某些細(xì)菌的DNA相似性不高;DNA雜交試驗結(jié)果也顯示,只有不到30%的DNA與弧菌屬相同,說明V.pacinii不同于弧菌屬其他菌種,目前未見更多相關(guān)報道。

J6菌株被鑒定為溶藻弧菌。溶藻弧菌廣泛地存在于世界各地海水與海產(chǎn)品中,其數(shù)量位于海洋類弧菌之首,是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種重要的條件致病菌[13]。關(guān)于溶藻弧菌吸附重金屬鎘的研究未見報道,如何能避免溶藻弧菌的致病性,又能安全利用它對鎘的吸附作用還有待探討。

J2和J6菌株生長的最適pH分別為7.0和7.5,但在pH為8時兩種菌也能較好地生長;最適生長溫度均在30℃以下;最適NaCl濃度分別為30、40 g/L。這說明這兩株菌都具有較好的耐鹽性,適應(yīng)海水的pH,可作為海洋環(huán)境重金屬污染生物修復(fù)的候選菌種。有關(guān)這兩種菌對重金屬的吸附位點、可能的轉(zhuǎn)化機理以及使用的安全性等是下一步研究的主要內(nèi)容。

[1] 孔志明.環(huán)境毒理學(xué)[M].2版.南京:南京大學(xué)出版社,2004.

[2] 黃銘洪,駱永明.礦區(qū)土地修復(fù)與生態(tài)恢復(fù)[J].土壤學(xué)報, 2003(2):161-163.

[3] 劉愛民.耐鎘細(xì)菌篩選與吸附鎘機理研究及其在鎘污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[4] 海洋監(jiān)測規(guī)范GB 17387.7-1998[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1998.

[5] 張漢波,鄭月,曾凡,等.幾株細(xì)菌的重金屬抗性水平和吸附量[J].微生物學(xué)通報,2005,32(3):29-34.

[6] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[7] Gomez-Gil B,Thompson F L,Thompson C C,et al.Vibrio pacinii sp.nov,from cultured aquatic organisms[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2003,53:1569-1573.

[8] Patil Y B,Paknikar K M.Removal and recovery of metal cyanides using a combination of biosorption and biodegradation processes [J].Biotechnology Letters,1999,21:913-919.

[9] Elhelow E R,Sabry S A,Amer R M.Cadmium biosorption by a cadmium resistant strain of Bacillus thuringiensis:regulation and optimization of cell surface affinity for metal cations[J].Bio Metals,2000,13:273-280.

[10] Lee H S,Volesky B.Evaluation of aluminum and copper biosorption in a two metal system using algal biosorbent[J].Environment Science,1999,2(2):149-158.

[11] 莫測輝,蔡全英,吳啟堂,等.微生物方法降低城市污泥的重金屬含量研究進展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2001,7(5):511 -515.

[12] 陳素華,孫鐵珩,周啟星,等.微生物與重金屬的相互作用及其應(yīng)用研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2002,13(2):239-242.

[13] 陳強,鄢慶枇,馬甡,等.溶藻弧菌致病性研究進展[J].海洋科學(xué),2006,36(8):83-89.

Isolation,identification and growth of Cd2+adsorption bacteria in coastal beach

WANG bin,CHENG Zhen-yuan,WANG Hui,ZHANG Xing,ZHOU Ya-fei,ZHOU Yi-bing
(Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Two Cd2+adsorption strains of bacteria J2 and J6 were isolated from coastal beach by general technique, and the adsorption of Cd2+was detected by Atomic Absorption Spectroscopy(AAS).The growth and biological characteristics of J2 and J6 were tested to identify the strains.The results showed that they can reduce Cd2+consistency in culture medium,while the amount of Cd2+in bacterial cells was found to be increased compared with the control (P＜0.05)7 days after culture.The J2 and J6 showed gram negative,rod shape,O129 paper sensitive,yellow colony in TCBS,catalase positive,oxidase positive,nitrate reduction positive and requirement of Na+for growth.The J2 and J6 were identified as genus Vibrio.The sequence of 16S rRNA gene of J2 was found to be accorded with Vibrio pacinii with identity of 99%,and J6 was accorded with Vibrio alginnolyticus with identity of 99%.The optimum growth of J2 was observed under the conditions of pH 7,20℃,NaCl of 3%and J6 pH 7.5,30℃,and NaCl of 40%.

Cd2+;bacterial adsorption;identification of bacterium;growth

Q93-331

A

2095-1388(2011)04-0333-05

2010-09-20

國家“863”計劃項目(2006AA102410);國家海洋局海洋公益項目(200805069)

王斌(1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn