李霞,周海燕,秦艷杰,郭娜,孫毅

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

仿刺參體壁再生形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的研究

李霞,周海燕,秦艷杰,郭娜,孫毅

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

用手術(shù)刀片切掉仿刺參體壁表皮層和結(jié)締組織層,深度至體腔膜。術(shù)后將仿刺參放入正常海水中飼養(yǎng),用肉眼和光學(xué)顯微鏡觀察仿刺參體壁再生的外部形態(tài)和組織學(xué)變化,并通過免疫熒光方法檢測小鼠抗人角蛋白19(CK19)的表達(dá)。形態(tài)學(xué)觀察表明:術(shù)后1 d,傷口呈凹陷狀,體腔膜上增生出一薄層乳白色結(jié)締組織;術(shù)后7 d傷口表面出現(xiàn)色素;術(shù)后11 d凹陷基本變平;術(shù)后21 d,傷口處體壁形態(tài)與顏色恢復(fù)至術(shù)前。組織學(xué)觀察表明:術(shù)后1 d,疏松結(jié)締組織直接暴露,創(chuàng)傷面附近有成纖維細(xì)胞和膠原纖維聚集;術(shù)后3 d,結(jié)締組織外層有上皮細(xì)胞聚集;術(shù)后4 d,結(jié)締組織間可見一條帶狀間隙;術(shù)后7 d,表皮外層出現(xiàn)角質(zhì)層;術(shù)后11 d,上皮層厚度接近正常組織,但結(jié)締組織較松散;術(shù)后21 d,上皮細(xì)胞數(shù)量、排列以及結(jié)締組織的排列同正常組織。免疫熒光檢測結(jié)果表明:CK19在正常的仿刺參體壁中表達(dá)得比較分散;術(shù)后3 d,CK19在創(chuàng)傷面附近集中表達(dá)。

仿刺參;體壁;再生;形態(tài)學(xué);組織學(xué)

目前,國內(nèi)外學(xué)者對仿刺參Apostichopus japonicus體壁的組織學(xué)[1]、體壁化學(xué)組成及活性物質(zhì)的提取工藝研究較多[2-3],而關(guān)于體壁再生的研究報(bào)道很少[4-5]。本研究中,作者采用人工手術(shù)方法在仿刺參體壁的疣足間形成創(chuàng)傷,肉眼和顯微鏡下觀察手術(shù)后體壁的變化,并采用免疫組織學(xué)方法研究了和表皮再生有關(guān)的CK19的表達(dá),旨在探討仿刺參體壁的再生機(jī)理,為仿刺參“化皮病”的防治提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參于2009年10月取自旅順龍王塘海區(qū),為自然生長個(gè)體,體質(zhì)量為30～60 g,共50個(gè)。取回后暫養(yǎng)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室生態(tài)室90 L的水槽中,飼養(yǎng)用水為砂濾海水,暫養(yǎng)10 d,每天定時(shí)半量換水1次,并投喂人工配合飼料。

試驗(yàn)用藥品包括:冷凍切片包埋劑(美國SAKURA公司)、丙酮、小鼠抗人角蛋白19單克隆抗體(CK19,英國Abcam公司)、FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人工創(chuàng)傷的形成 取仿刺參于冰上麻醉0.5 h,用無菌解剖刀在仿刺參體壁疣足間切掉表皮層和結(jié)締組織層,形成面積約1 cm2的創(chuàng)傷面,深度至體腔膜。將手術(shù)后的仿刺參放回水槽中繼續(xù)飼養(yǎng)。試驗(yàn)進(jìn)行21 d。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 每天用肉眼觀察手術(shù)后仿刺參體壁傷口的愈合情況,并用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.2.3 組織學(xué)樣品的制備 仿刺參術(shù)后1～7 d,每天取樣;8～21 d,隔天取樣。取樣時(shí)從水槽中隨機(jī)選取3個(gè)仿刺參,用硫酸鎂(0.54 mol/L)麻醉2 h,取創(chuàng)傷處體壁組織1 cm×1 cm×0.5 cm,用Bouin's液固定,常規(guī)石蠟包埋,LeicaRM2135型切片機(jī)切片,厚度為5 μm。用H.E染色,中性樹膠封片,在Olympus顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫熒光樣品的制備 隨機(jī)選取正常和手術(shù)后3 d的仿刺參各3個(gè),在冰塊上麻醉0.5 h。取體壁組織1 cm×1 cm×0.5 cm,用冷凍切片包埋劑包埋,再用LeicaCM1900MDL冷凍切片機(jī)切片,厚度為5 μm。切片后按以下步驟處理:用丙酮固定15 min后取出載玻片,用濾紙吸干多余水分,滴加50 μL適當(dāng)稀釋的小鼠抗人CK19(1∶50),使其完全覆蓋標(biāo)本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃下恒溫箱內(nèi)保溫1 h。對照組用PBS代替一抗。取出載玻片,用濾紙吸干多余水分,滴加50 μL用FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG,避光45 min。加一滴甘油封片,立即在Olympus熒光顯微鏡下觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度并拍照。兩步驟之間都用0.01 mol/L的PBS(pH為7.4)沖洗3次,每次5 min。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)后仿刺參體壁形態(tài)學(xué)的變化

試驗(yàn)中沒有個(gè)體死亡,僅在術(shù)后第一天觀察到2個(gè)仿刺參有吐腸現(xiàn)象。手術(shù)后0 h,將創(chuàng)傷部位的體壁去除,創(chuàng)面可見體腔膜。手術(shù)后切口處體壁立即收縮,創(chuàng)口閉合,身體聚縮,仿刺參以管足吸附在槽底(圖1-A)。手術(shù)后1 d,仿刺參基本伸展恢復(fù)常態(tài),傷口處呈凹陷狀,體腔膜上增生一薄層乳白色結(jié)締組織(圖1-B)。手術(shù)后6 d,結(jié)締組織增厚,凹陷程度降低(圖1-C)。手術(shù)后7 d,傷口與周圍表皮連接處出現(xiàn)色素,并逐漸延伸到傷口中心(圖1-D)。手術(shù)后11 d,色素增多且與正常體壁顏色相近,凹陷基本變平(圖1-E)。手術(shù)后21 d,體壁形態(tài)與顏色恢復(fù)至術(shù)前(圖1-F)。

2.2 手術(shù)后仿刺參體壁組織學(xué)的變化

手術(shù)后1 d,仿刺參體壁已去除,疏松結(jié)締組織直接暴露,創(chuàng)傷面凹陷,附近有成纖維細(xì)胞和膠原纖維聚集(圖1-G)。手術(shù)后3 d,創(chuàng)傷處結(jié)締組織外層有上皮細(xì)胞聚集,細(xì)胞排列雜亂疏松(圖1-H)。手術(shù)后4 d,創(chuàng)傷處上皮細(xì)胞數(shù)量增加,并形成一薄層,細(xì)胞排列仍不規(guī)則?？拷韺拥慕Y(jié)締組織疏松,與內(nèi)層結(jié)締組織間形成一條帶狀間隙(圖1-I)。手術(shù)后7 d,新生表皮層增厚,上皮細(xì)胞密集,與結(jié)締組織連接緊密。表皮外層出現(xiàn)角質(zhì)層。間隙帶內(nèi)的成纖維細(xì)胞和膠原纖維增多,排列逐漸均勻(圖1-J)。手術(shù)后11 d,上皮細(xì)胞層和角質(zhì)層厚度接近正常組織,只是上皮細(xì)胞排列仍顯凌亂。結(jié)締組織間隙帶基本彌合(圖1-K)。手術(shù)后21 d,上皮層細(xì)胞數(shù)量和排列同正常組織,結(jié)締組織分布均勻(圖1-L)。

2.3 免疫熒光檢測結(jié)果

與對照組(圖1-M)相比,CK19在正常和再生的仿刺參體壁中均有陽性表達(dá),只是表達(dá)的部位和程度有所區(qū)別:在正常的仿刺參體壁中,CK19分布得比較分散,在體壁的不同部位均有陽性表達(dá)(圖1-N)。手術(shù)后3 d,CK19在創(chuàng)傷面附近集中表達(dá),形成一條發(fā)亮的條帶(圖1-O)。

3 討論

3.1 仿刺參體壁的再生能力

器官再生的持續(xù)時(shí)間因種類不同而不同。如腸的再生,擬刺參需145 d,仿刺參需14 d[6],糙海參僅需7 d[7];體壁再生,硬瓜參需20～30 d[5],本試驗(yàn)中仿刺參為20 d。日常觀察發(fā)現(xiàn),仿刺參若受到機(jī)械損傷或用手術(shù)刀片切掉輕微化皮的體壁,短時(shí)間內(nèi)體壁可以修復(fù)完好。本試驗(yàn)中將體壁大部分組織切除,只留下體腔膜,仿刺參也能將缺失的部分修復(fù)完整,說明仿刺參體壁的再生能力很強(qiáng)。

3.2 仿刺參體壁表皮和結(jié)締組織再生機(jī)制的分析

研究表明,海參再生有3種模式:變形再生(Morphallaxis)、新建再生(Epimorphosis)以及兩種再生機(jī)制的結(jié)合。Dolmatov等[8]報(bào)道的海參體壁縱肌的再生過程和Gibson等[9]報(bào)道的無足類海參Leptosynapta體壁橫切后的腸再生都屬于變形再生; H.glaberrima腸的再生、H.forskali居維爾氏小管的再生[10]是變形再生和新建再生結(jié)合的典型例子。

組織切片觀察可見,對仿刺參手術(shù)后3 d,傷口表面出現(xiàn)較多數(shù)量的表皮細(xì)胞,而免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)該區(qū)域有大量CK19的陽性表達(dá)。CK19是表皮干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[11-12]。Lyte等[13]的研究表明,CK19陽性的細(xì)胞可能是“早期”短暫擴(kuò)增細(xì)胞或表皮干細(xì)胞,而短暫擴(kuò)增細(xì)胞也是由干細(xì)胞分裂而來的,這些細(xì)胞通常位于基膜附近。由于仿刺參上皮組織和結(jié)締組織間無基膜,所以正常情況下CK19陽性細(xì)胞分散在結(jié)締組織中,在體壁再生初期集中在傷口處并不斷分裂增殖,向表皮遷移、分化為新的上皮細(xì)胞。所以仿刺參體壁表皮的再生機(jī)制屬于新建再生。

圖1 仿刺參體壁的再生形態(tài)學(xué)(A～F)和組織學(xué)(G～O)觀察Fig.1 Morphology(A-F)and histology(G-O)of the regenerated body wall of sea cucumber Apostichopus japonicus

組織切片觀察還發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷面附近聚集大量的成纖維細(xì)胞。創(chuàng)傷后4 d,結(jié)締組織中出現(xiàn)帶狀間隙。這是因?yàn)榇罅康慕Y(jié)締組織成分向表面移動(dòng)造成的,以后隨成纖維細(xì)胞分泌的纖維和基質(zhì)的增多,填補(bǔ)了間隙,結(jié)締組織結(jié)構(gòu)變得均勻同正常。在人體中深達(dá)真皮的損傷是由瘢痕來修復(fù)的,而成纖維細(xì)胞在瘢痕發(fā)生中起著重要作用,如細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成、分泌以及膠原纖維的形成[14]。ECM主要由膠原蛋白、蛋白多糖和纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)組成。已有研究證明[15],在傷口愈合的各個(gè)時(shí)期,均有纖維黏連蛋白的參與,其含量在傷口區(qū)大量增加。筆者推測:成纖維細(xì)胞在仿刺參體壁再生過程中的作用與人體相似,即通過分泌大量的膠原纖維和纖維黏連蛋白促進(jìn)傷口的修復(fù)。所以仿刺參體壁結(jié)締組織的再生屬于變形再生。

[1] 聶竹蘭,李霞,辛濤.仿刺參體壁的組織學(xué)和組織化學(xué)[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(3):184-187.

[2] 姜健,楊寶靈,邰陽.海參資源及其生物活性物質(zhì)的研究[J].生物技術(shù)通訊,2004,15(5):537-540.

[3] 沈鳴.海參的化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J].中成藥,2001,23 (10):758-761.

[4] 李霞,聶竹蘭,魏杰.仿刺參體壁表皮再生組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2007,14(7):1-6.

[5] Garcia-Arraras J E,Estrada-Rodgers L,Santiago R,et al.Cellular mechanisms of intestine regeneration in the sea-cucumber Holothuria glaberrina Selenka(Holothuroidea:Echinodermata)[J].J Exp Zool,1998,281:288-304.

[6] 孫修勤,鄭法新,張進(jìn)興.海參綱動(dòng)物的吐臟再生[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2005,35(5):719-723.

[7] Bai M M.Regeneration in the Holothurian,Holothuria scabra jager [J].Indian J Exp Biol,1971,9:467-471.

[8] Dolmatov I Yu,Eliseikina M G,Ginanova T T,et al.Muscle regeneration in the holothurian Stichopus japonicus[J].Development Genes and Evolution,1996,205:486-493.

[9] Gibson A W,Burke R D.Gut regeneration by morphallaxis in the sea cucumber Leptosynapta clarki(Heding,1928)[J].Can J Zool, 1983,61:2720-2732.

[10] Vanden-Spiegel D,Jangoux M,Flammang P.Maintaining the line of defense:Regeneration of cuvierian tubules in the sea cucumber Holothuria forskali(Echinodermata,Holothuroidea)[J].The Biological Bulletin,2000,198(1):34-49.

[11] Michel M,Torok N,Godbout M J,et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro:keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites,and their mumber varies with donor age and culture stage [J].J Cell,1996,109:1017-1020.

[12] Michel M,L'Heureux N,Auger F A,et al.From newborn to adult: phenotypic and functional properties of skin equivalent and human skin as a function of donor age[J].J Cell Physio,1997,171:179-181.

[13] Lyte S,Christofidou-Solomidou M,Liu Y,et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci,1998,111: 3179-3184.

[14] 趙燁德,牛星燾,肖軍軍.增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞活性功能研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,1998,12(2):108-112.

[15] Cheng C Y.Fibeonectin enhances healing of excised wounds in rats[J].Arch Dermatol,1988,124:221-224.

Morphology and histology of the regenerated body wall of sea cucumber Apostichopus japonicus

LI Xia,ZHOU Hai-yan,QING Yan-jie,GUO Na,SUN Yi
(Key Laboratory of Mariculture,Agriculture Ministry,PRC,Dalian Ocean Univ.,Dalian 116023,China)

The morphology and histological changes were observed in the regenerated body walls in sea cucumber Apostichopus japonicus whose epidermis and the connective tissue layer were cut off and reared in the sea water by naked eye and a light microscopy.The CK19 was expressed in the mice by fluorescence radioimmunoassay.A thin milky connective tissue was found in the body cavity membranes and hollowness was visible 1 day after regeneration.Pigment was appeared 7 days after regeneration,and no hollowness 11 days after regeneration.21days after regeneration,the wound epidermis configuration and color was recovery to the original.Histologically,1 day after connective tissue was exposed directly,and in fibroblasts and collagen congregated fibers were the vicinity of trauma surface.3 days after regeneration,a large number of epithelial cells were in the outer layer of connective tissue, and 4 days after regeneration,a band gap became obvious between the connective tissues.7 days after regeneration, the keratose layer appeared out of the epidermis layer,and 11 days after regeneration,the thickness of epidermis layer and keratose layer were consistent with the normal state.21 days after regeneration,the number and arrangement of epidermis cells were the same as the normal tissue,and connective tissue was homogeneous.The confocal microscopy analysis showed that the natural body wall of the sea cucumber had expression of CK19 dispersedly.3 days after regeneration,the CK19 was expressed in the vicinity of trauma surface.

Apostichopus japonicus;body wall;regeneration;morphology;histology

Q246

A

2095-1388(2011)04-0287-04

2010-09-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30371099);遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20052139);遼寧省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2007T015);遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2008S064)

李霞(1961-),女,教授。E-mail:lx@dlou.edu.cn