牛曉靜,施鈞瀚

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,河南鄭州 450000)

達(dá)原顆粒是本院院內(nèi)制劑,由粉葛、柴胡、黃芩、厚樸等 8味中藥組成,具有清熱解表、除濕清導(dǎo)功效,臨床被用于治療小兒瘟疫頭痛、發(fā)熱惡寒、腹脹嘔吐、食積化熱、暑濕泄瀉等。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(河南省食品藥品監(jiān)督管理局制劑注冊(cè)批件第 2004Z01489號(hào)附質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))中只有其薄層鑒別。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量,筆者采用高效液相色譜法對(duì)葛根素的含量進(jìn)行了測(cè)定[1],并對(duì)柴胡、黃芩、厚樸進(jìn)行薄層鑒別,以期為該藥的質(zhì)量控制提供更有效的方法。

1 藥品、試劑與儀器

達(dá)原顆粒(批號(hào) 100129,100224,100804)由醫(yī)院制劑室提供,中藥飲片由醫(yī)院中藥房提供。葛根素對(duì)照品(110752-200511)、黃芩苷對(duì)照品(110715-200815)、厚樸對(duì)照藥材(121285-200301)、厚樸酚對(duì)照品(110729-200309)、和厚樸酚對(duì)照品(110730-200307)及柴胡對(duì)照藥材(120992-200504),均由中國(guó)生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純;水為純凈水;其他化學(xué)試劑均為分析純。島津LC-10ATVP型高效液相色譜儀,產(chǎn)地日本;SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,產(chǎn)地日本;CLASS-VP色譜工作站,產(chǎn)地日本;Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6mm×250 mm,5μm),產(chǎn)地美國(guó);超聲波清洗器(功率250W,頻率50 kHz),昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 薄層鑒別

2.1 柴胡的薄層鑒別

取本品 5 g,研細(xì);加甲醇 20 m L,超聲處理10min,濾過(guò);濾液濃縮至約 5 m L,作為供試品溶液。同法處理缺柴胡陰性對(duì)照溶液。另取柴胡對(duì)照藥材0.5 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法(2010版《中國(guó)藥典》附錄VI B)進(jìn)行試驗(yàn)。吸取上述3種溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-無(wú)水乙醇-水(8∶2∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi),取出,晾干,噴以 2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,在 60℃加熱至斑點(diǎn)清晰,置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn),陰性對(duì)照在相應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2 黃芩的薄層鑒別

按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液及缺黃芩陰性對(duì)照溶液。另取黃芩對(duì)照藥材 1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液;再取黃芩苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(2010版《中國(guó)藥典》附錄Ⅵ B)進(jìn)行試驗(yàn)。吸取上述3種溶液各 5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑,飽和30 min,展開(kāi),取出,晾干,噴以 1%三氯化鐵乙醇溶液,在日光下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn);在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯一相同的暗綠色斑點(diǎn);陰性對(duì)照在相應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖 1。

2.3 厚樸的薄層鑒別

按 2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液、厚樸對(duì)照藥材溶液及缺厚樸陰性對(duì)照溶液。另取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品,加甲醇制成每1 m L各含1mg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(2010版《中國(guó)藥典》附錄ⅥB)進(jìn)行試驗(yàn)。吸取上述兩種溶液各 5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以 1%香草醛硫酸溶液,在 100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照在相應(yīng)位置上無(wú)斑點(diǎn)。見(jiàn)圖 1。

圖1 柴胡(A)、黃芩(B)、厚樸(C)鑒別薄層色譜圖

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱為Aglient Eclipse XDB-C18柱(4.6mm× 250mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75),檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm,流速1.0 mL/m in,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于 4 000。

3.2 供試品溶液的制備

取本品(批號(hào)100129)適量,研細(xì),取2.5 g,精密稱定,置50 mL容量瓶中,加入30%乙醇至刻度,超聲提取30min,過(guò)濾,取續(xù)濾液即得。進(jìn)樣前過(guò)微孔濾膜即可。

3.3 對(duì)照品溶液的制備

葛根素對(duì)照品溶液的配制:取葛根素對(duì)照品適量,精密稱定,加 30%乙醇溶解,制成每1 m L含葛根素82μg的溶液,即得。

3.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)

按處方比例稱取除粉葛以外的其余藥材,按達(dá)原顆粒制備工藝制備,按 3.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。將供試品溶液,陰性對(duì)照溶液以及葛根素對(duì)照品溶液,分別注入液相色譜儀,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果,陰性無(wú)干擾,見(jiàn)圖 2。

圖2 達(dá)原顆粒高效液相色譜圖

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取上述葛根素對(duì)照品溶液 1,2,4, 6,8,10,12μL,按上述色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程分別為Y=291 250 X-15 175(γ= 0.999 9)。結(jié)果表明,葛根素進(jìn)樣量在 0.082～0.984μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

吸取同—份供試品(批號(hào)100129)溶液,連續(xù)進(jìn)樣 5次,按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果:葛根素峰面積RSD=0.14%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)100129)適量,按3.2項(xiàng)下方法制備 6份供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果:葛根素含量為0.25 mg/g,RSD=0.19%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品(批號(hào)100129)溶液,按上述色譜條件分別于 0,2,4,6,8 h測(cè)定葛根素面積積分值。結(jié)果:葛根素RSD=0.79%。結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一樣品(批號(hào)100129)6份,每份精密稱取1.25 g,分別加入 82 mg/L的葛根素對(duì)照品溶液4m L,按 3.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液,依法測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果,葛根素平均回收率為98.88%,RSD=1.19%(n=6),見(jiàn)表1。

3.10 樣品含量測(cè)定

分別取 3個(gè)批次的樣品(批號(hào) 100129,100224, 100804),按 3.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果:3批樣品中葛根素含量分別為0.25,0.23,0.26mg/g。結(jié)果表明葛根素在各批次間的含量差異較小,提示達(dá)原顆粒中葛根素含量穩(wěn)定。

表1 葛根素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=6

4 討 論

在黃芩的薄層鑒別試驗(yàn)中,筆者曾采用《中國(guó)藥典》方法[1]282,結(jié)果黃芩苷斑點(diǎn)的 Rf值較小,幾乎在原點(diǎn)附近。后又參照文獻(xiàn)[2]將樣品點(diǎn)于硅膠G薄層板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑,結(jié)果分離效果較好,且陰性無(wú)干擾。有關(guān)厚樸的薄層鑒別,《中國(guó)藥典》以甲苯-甲醇(27∶1)作展開(kāi)劑,結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚分離度較差,且甲苯有較大毒性。筆者經(jīng)多次試驗(yàn),選用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.1)為展開(kāi)劑,分離效果好,試劑毒性小,且陰性無(wú)干擾。

在進(jìn)行含量測(cè)定時(shí),筆者針對(duì)供試品溶液的制備考察了以下兩種提取方法:選擇用 30%乙醇提取,分別采用加熱回流及超聲 30 min處理,結(jié)果所得葛根素含量差別不大。因?yàn)槌曁崛≥^為方便,且重復(fù)性好,所以采用30%乙醇超聲30 min處理。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:272,282.

[2]卞艷晶,高延甲,王建.四季三黃片質(zhì)量控制方法的研究[J].齊魯藥事,2010,29(1):20-22.