司 高

(鄭州外國(guó)語(yǔ)學(xué)校,河南鄭州 450001)

筆者既往研究發(fā)現(xiàn),核桃仁醇提物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用[1]。為了探討核桃仁醇提物對(duì)癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)觀察了核桃仁醇提物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人骨肉瘤細(xì)胞株Hosp36、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和人肺腺癌細(xì)胞株A549均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。

1.2 藥品、試劑與儀器

核桃(Juglans regia L.)購(gòu)自鄭州土產(chǎn)商店。取其仁50 g,加入無(wú)水乙醇250 mL浸泡1周;濾紙過(guò)濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀58℃濃縮藥液;真空干燥,獲得棕黃色油狀的核桃仁醇提物;用二甲基亞砜(DMSO)溶解為 300 g/L的貯存液,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用不含血清培養(yǎng)基配成所需濃度,以0.22μm濾膜過(guò)濾,加入血清后使用。RPMI 1640和MEM培養(yǎng)基,Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清,Gibco公司產(chǎn)品;苯甲基磺酰氟(PMSF)和亮抑制肽(Leupeptin),Am resco公司產(chǎn)品;丙烯酰胺,Biomol公司產(chǎn)品;胰蛋白酶與辣根過(guò)氧化物酶偶合的山羊抗小鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP,華美公司產(chǎn)品;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminecence,ECL)試劑盒,Santa Cruz公司產(chǎn)品;磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)單克隆抗體,韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)國(guó)家信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelialgrowth factor receptor,EGFR)單克隆抗體,Santa Cruz公司產(chǎn)品;蛋白激酶Cα(PKCα)多克隆抗體(Santa Cruz公司產(chǎn)品)、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),均由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所提供;考馬斯亮藍(lán)G250,Am resco公司產(chǎn)品;硝酸纖維素膜,Life Science公司產(chǎn)品;其他化學(xué)試劑均為分析純,商業(yè)購(gòu)得。Heraeus細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國(guó)Kendro公司產(chǎn)品; Axiovert 25倒置顯微鏡,Zeiss公司產(chǎn)品;BioMate紫外分光光度計(jì),Thermo公司產(chǎn)品;SG-603生物安全柜,Bake公司產(chǎn)品;pH測(cè)定儀,意大利HANNA公司產(chǎn)品;可調(diào)移液器 P1000、P200、P100、P20,均為Gilson公司產(chǎn)品;12通道加樣器,Thermo公司產(chǎn)品;蛋白電泳系統(tǒng),Bio-Rad公司產(chǎn)品;ChemiDoc XRS成像分析系統(tǒng),BIO-RAD公司產(chǎn)品;ROTINA 35型離心機(jī),德國(guó)Hettich公司產(chǎn)品;3-18K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),Sigma公司產(chǎn)品;RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;DZF-6050真空干燥箱和DK-S24型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;自動(dòng)消毒鍋,TOMY公司產(chǎn)品;超純水制備儀,LABCONCO公司產(chǎn)品;78-1型磁力加熱攪拌器,江蘇姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品; VCX750超聲破細(xì)胞破碎儀,Sonics＆Materials公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出癌細(xì)胞株,水浴解凍;吸出細(xì)胞懸液移入15 mL離心管中;加入10 mL無(wú)血清培養(yǎng)基,混勻;1 000轉(zhuǎn)/min離心10min,棄上清,將細(xì)胞接種于含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液中,Hosp36和MCF-7細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基,SKOV3和A549細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基;于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每間隔 48 h更換 1次培養(yǎng)基;待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合率時(shí),用胰蛋白酶溶液(用D-Hans液配制,含0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸二鈉, pH值為8.3)消化,按實(shí)驗(yàn)要求接種于96孔培養(yǎng)板中或 Φ100培養(yǎng)皿中。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

采用免疫印跡法[2]測(cè)定細(xì)胞中EGFR、PLC-γ1、 PKCα蛋白含量。將細(xì)胞接種在 Φ100培養(yǎng)皿中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;分別按IC50藥物濃度加入藥物,抑制骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值分別為108.050,216.654,254.153, 593.244mg/L;培養(yǎng)48 h,收獲細(xì)胞,用細(xì)胞裂解液(由20mM HEPES、pH值為7.2,10%甘油,50 mM NaCl,1%TritonX-100,1 mM Na3VO4,10mg/L Leupeptin和1mM PMSF組成)裂解;14 000 g、4℃離心15min,收集上清,用Bradford法測(cè)定蛋白濃度, 20μg/孔上樣,經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%SDS-PAGE);分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉TTBS溶液(由10 mM Tris、pH值為7.6,150 mM NaCl,0.05%Tween-20組成)封閉濾膜1 h;每張膜用所要檢測(cè)蛋白相應(yīng)的抗體室溫反應(yīng)4～6 h;用TTBS洗滌30m in;用相應(yīng)的羊抗鼠或羊抗兔IgG-HRP反應(yīng)2 h,用TTBS洗滌30min;將膜轉(zhuǎn)入另一塑料袋中,加入ECL試劑A、B液,封口;將硝酸纖維素膜放于暗盒中,放上 X光膠片曝光,顯影,定影,洗片。

2 結(jié) 果

與對(duì)照組相比,以核桃仁醇提物處理過(guò)的細(xì)胞的蛋白顯影條帶減弱,說(shuō)明核桃仁能下調(diào)癌細(xì)胞EGFR、PLC-γ1和PKCα蛋白表達(dá)水平,其作用強(qiáng)弱依次為骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌。見(jiàn)圖 1。

圖1 核桃仁醇提物對(duì)4種癌細(xì)胞EGFR、PLC-γ1和PKCα蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合向細(xì)胞核傳遞生長(zhǎng)信號(hào)引起細(xì)胞正常生長(zhǎng),異常增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)是癌細(xì)胞失控生長(zhǎng)的關(guān)鍵原因。抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳遞是抗癌藥物研制的重要途徑。本研究觀察了核桃仁醇提物是否能夠通過(guò)抑制EGFR生長(zhǎng)信號(hào)傳遞來(lái)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。EGFR生長(zhǎng)信號(hào)傳遞過(guò)程是EGFR→PLC-γ1→PKCα→細(xì)胞生長(zhǎng)。EGFR是跨細(xì)胞膜受體,分子量為170 kDa;PLC-γ1是細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)蛋白,分子量為145 kDa;PKCα是胞漿蛋白,分子量為80 kDa。各種原因引起EGFR、PLC-γ1、PKCα過(guò)量表達(dá)或EGFR細(xì)胞內(nèi)部分的酪氨酸磷酸化而高度激活,均會(huì)依次使PLC-γ1、PKCα磷酸化,而這些都會(huì)使癌細(xì)胞失控生長(zhǎng)。免疫印跡方法是根據(jù)抗體與抗原特異性結(jié)合的原理,先將蛋白通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子量大小分離開(kāi)來(lái),然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,再用已知抗體與膜上蛋白反應(yīng),結(jié)合上的抗體再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng),最后加入酶聯(lián)抗體生色底物或發(fā)光底物,在膜上抗原抗體結(jié)合處顯示染色蛋白條帶,或用 X光片曝光,在膠片上出現(xiàn)蛋白顯影條帶,根據(jù)條帶的有無(wú)、位置和深淺可以鑒定細(xì)胞或組織樣品中是否有相應(yīng)蛋白的表達(dá)、分子量的大小及表達(dá)量的多少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡方法檢測(cè)核桃仁醇提物對(duì)癌細(xì)胞中EGFR、PLC-γ1、PKCα表達(dá)的作用,發(fā)現(xiàn)核桃仁醇提物能明顯抑制癌細(xì)胞中EGFR、PLC-γ1、PKCα表達(dá)水平,說(shuō)明核桃仁醇提物抑制癌細(xì)胞EGFR→PLC-γ1→PKCα的生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)是其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要機(jī)制。

核桃仁歷來(lái)被視為營(yíng)養(yǎng)保健的安全果品,具有補(bǔ)腎溫肺潤(rùn)腸[3-4]、抗氧化[5]和增強(qiáng)免疫作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)核桃仁醇提物確有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,并揭示出它抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的一種重要分子機(jī)制。

[1]司高.核桃仁醇提物抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中醫(yī)研究,2011,24(1):26-29.

[2]J.薩姆布魯克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1992:880-897

[3]雷載權(quán).中藥學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1995: 297.

[4]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2009:2182.

[5]湯昆.核桃仁抗氧化活性成分對(duì)自由基DPPH清除時(shí)間和清除率的研究[J].中成藥,2009,31(8):1287-1288.

[6]盛強(qiáng).核桃仁水提液對(duì)免疫功能低下模型小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2006,13(4):242-243.